全プラスミドの自家製のサイトが特異的突然変異誘発

Summary

全体プラスミドの部位特異的突然変異誘発は、元のプラスミドのわずかに異なるバリエーションを作成する簡単な方法です。ここでは、プラスミドを使用して、標準試薬に塩基置換を導入しやすいと費用対効果の高い方法を示しています。

Abstract

全体プラスミドの部位特異的突然変異誘発は、元のプラスミドのわずかに異なるバリエーションを作成する簡単な方法です。この方法ではクローン化された標的遺伝子は、直接プラスミドに数個の塩基の置換、欠失または挿入することで変更できます。これは単に非PCRベースの熱サイクル反応で、全体のプラスミドを増幅することによって動作します。反応中に所望の変異を運ぶ突然変異誘発性プライマーは、、、新たに合成されたプラスミドに組み込まれています。このビデオチュートリアルでは、プラスミドに塩基置換を導入しやすいと費用対効果の高い方法を示しています。プロトコルは、標準試薬と連携し、多くの場合非常に高価な市販のキット、から独立しています。このプロトコルを適用すると、それは市販のキットのいくつかを使用して、かかるコストの8位に反応のトータルコストを削減することができます。このビデオでは、また、プロセス中の重要な手順についてはコメントおよび突然変異誘発プライマーを設計する方法に関する詳細な指示を与える。

Protocol

法の原理：

このビデオで説明されている全プラスミドの変異導入を指揮サイトでは、直接プラスミドに数個の塩基の置換、欠失または挿入によってクローニングされた標的遺伝子を変化させることができる突然変異誘発法です。それ以外のPCRベースの熱サイクル反応で、全体のプラスミドを増幅することによって動作します。反応中に、元のプラスミドにミスマッチの形で、目的の変異を有する変異誘発プライマーは、、、新たに合成されたプラスミドに組み込まれています。反応から元のプラスミドを除去した後に変異プラスミドは、E.に変換されるこのメソッドの変異の効率が100％ではないので、 大腸菌。次の手順では、唯一のスクリーニングを目的としています。全体の手順は、3日かかりますが、主な部分は、1日以内に行うことができます。

1.0 1日目：

1.1熱サイクル反応：

オリジナルのプラスミド：変異誘発プロトコルを指示このサイトは、最大10キロバイトまでのプラスミドで最高の作品。大きなプラスミドは、この方法で変異するのが少し困難であり、いくつかの忍耐と熱サイクル条件及び/またはコンピテントセルの調整がかかることがあります。さらに、作業対象とするプラスミドは、ダム+細菌の菌株から分離されていなければなりません。熱サイクル反応のためにあなたが変異するプラスミドの10から60 NGSが必要になります。

プライマー：あなたの熱サイクル反応をセットアップする前に手元にプライマーを持たなければならない。あなたはすべての変異プライマーの約150 ngを必要。あなたが10倍希釈100 PMの株式の1.5μlを取ればそれはOKです。あなたの突然変異誘発プライマーを設計する際に考慮すべきいくつかの簡単なガイドラインがあります：

• プライマーは、互いに相補的である必要があります
• プライマーは、長さ25から45ヌクレオチドの間でなければなりません
• オリジナルのプラスミドへのミスマッチの形の変異は、両方のプライマーに含まれている必要があります
• 不一致は、プライマーの中央と両側に少なくとも8ヌクレオチドが隣接する必要がある
• プライマーは、少なくとも40％のGC含量を持つ必要があります
• プライマーは、1つまたは複数のGSまたはCsで5'と3素数を止めるべきである
• プライマーは、リン酸化されることが必要ではない、また彼らは単に彼らがあるべき脱FPLCまたはPAGE精製、しなければならないのか。
• Tmの計算では、出荷証明書上の任意の式がTmが60℃より高くすべき必要はありません。
• スクリーニングの目的のためにそれはあなたの突然変異で制限部位を挿入または削除することが現実的です。ために遺伝子コードの変性のご所望の変異で制限部位を挿入するために多くの可能性があります。ニューイングランドバイオラボのウェブサイトは、適切な制限部位を検索するためのツールが用意されています。単にDNAの曖昧さのコードを使用して、あなたが望むのアミノ酸配列をコードするあなたのプライマー配列を入力してください。酵素のファインダーツールでは、制限部位が、ご希望の突然変異に平行に導入することができることを教えてくれます。この方法によってあらゆる可能性や実用的制限部位を見つけることができない場合には、突然変異の部位で遺伝コードを操作せずに、新しい制限部位を挿入することができます。その後、この制限部位が新たな突然変異誘発プライマーの挿入によって削除されるの変異のシリーズ用のテンプレートとしてプラスミドを使用することができます。あなたがプラスミドの同じ部位での突然変異の一連の操作を行うことを計画している場合は、このアプローチは非常に便利であるかもしれません。

DNA -ポリメラーゼ：この方法を使うには3' - 5'エキソヌクレアーゼ活性を示し、平滑末端を生成する耐熱性DNA -ポリメラーゼが必要です。我々は常にFermentasから組換えPFU -ポリメラーゼを使用してください。あなたが増幅ステップで問題を持っている場合は、より品質の高いポリメラーゼを試す可能性がありますが、ほとんどの目的のために標準PFUは十分だろう。のdNTP、ポリメラーゼ緩衝液と水との反応を完了します。

1.2熱サイクル条件

サーモサイクラーは以下の方法で設定する必要があります。初期および定期的な変性段階を95℃で30秒に設定されています

プライマーのアニーリング温度は、複雑な数式で計算してはいけません。我々は、通常55℃、1分アニール時間にアニーリング温度を設定します。あなたが主に使用する25から30ヌクレオチドのプライマーの場合は、これは私達のための時間の95％に動作します。と60℃ - これが動作しないかどうかいずれにせよ、単に50の間にアニーリング温度を変えてみ

延伸温度は、使用するポリメラーゼによって異なります。このデモでは、72℃の伸長温度を呼びかけFermentas、からPFU -ポリメラーゼを使用して伸長時間は、プラスミドのサイズによって異なります。我々は常にkbあたり1分を計算し、そのための1分を追加時間。例えば、9キロバイトプラスミドのために我々は、伸長時間として10分を選択することになります。

18サイクルは十分にさらに使用するためのプラスミド変異作成するだけで十分です。サイクル数を低く保つこと、また、時間を節約できます。

熱サイクル反応後の1.3 Gelcheck

成功した増幅、電気泳動を行うことによりチェックする必要があります。サイクリングが終了した直後に、1％TAEアガロースゲルに反応液5μlをロードする。増幅が成功した場合には、明瞭なバンドが表示されるはずです。新たに合成されたDNAは、ゲル上で明確に表示されていない場合ただし、全体の反応を沈殿させるために試みると、次のステップで変換のためにそれを使用することができます。私たちにとってこのことはほとんど働いていないが、それは試してみる価値はある。反応が動作しない場合は最善の方法は、アニーリング温度を調整することです。

1.4 DpnI消化：

変換する前にテンプレートを務めた元のプラスミドは、強力なバックグラウンドを防ぐために、反応から削除する必要があります。これは、DpnIで制限酵素消化によって行われます。この制限エンドヌクレアーゼは、メチル化プラスミドカット。メチル化される必要があるのに対し、その認識と制限部位は、配列GATCです。 DpnIで切断するときにダムから隔離された唯一のオリジナルunmutatedプラスミドを+株はカットさ、メチル化されていない新たに合成された変異プラスミドは、DpnIの影響を受けません。単に反応するDpnIの1〜2μLを追加し、37℃で少なくとも1時間振とうする。高速ダイジェストDpnIを使用する場合はインキュベーション時間は約15分に短縮することができます。あなたのDpnIとこの制限酵素消化のインキュベーション時間の質が大幅unmutatedプラスミドを持つあなたの背景がどのくらい強いかを決定します。

1.5変換：

DpnIの消化後にプラスミドは、コンピテント大腸菌への形質転換のための準備ができています大腸菌細胞。単純にコンピテント細胞にDpnIの消化反応から5μlを追加し、ラボで推奨されている変換を実行します。我々のケースでは、氷上で30分間細菌プラスミド混合物をインキュベートし、42℃90秒で、熱衝撃、それによって熱ショックプロシージャを使用します。 200μlのSOC -ソリューションを追加した後、細菌が培養される、精力的に揺れて、37℃で1時間C 1時間後に細菌を寒天培地を選択することでメッキされています。

2.0 2日目

クローンのパート1の2.1スクリーニング：クローンの選定

突然変異の効率が100％ではないため、あなたの突然変異体をスクリーニングする必要があります。我々は我々が追加またはプライマーの統合により削除さ制限部位の有無をチェックする制限酵素で消化することによって行います。この目的のために我々は、通常8コロニーをピックアップし、翌日のプラスミド調製のために一晩、それらを成長させる。

3.0 3日目

クローンのパート2の3.1スクリーニング：マーカー酵素と制限酵素処理

三日目に、あなたのマーカー酵素でミニプレップし、その後の制限酵素消化を行う。ゲル上では、その後、所望の変異を運ぶとなるものではない自分のクローンのどれを見ることができます。

制限酵素消化を用いたスクリーニング方法は、非常にうまく機能します。それにもかかわらず、あなたは配列決定によってあなたの成功の変異を確認する必要があります。

Discussion

部位特異的突然変異誘発は、プラスミドによって運ばれる遺伝子を変異させる高速な方法を提供する変異導入法です。全体の反応は、一日で行うことができます。この方法では、それだけで所望の変異とそのようなPFU -ポリメラーゼのようなプルーフリーディングポリメラーゼを運んで無料のプライマーのペアが必要になります。新たに合成されたプラスミドを制限酵素DpnIとの反応を消化して親プラスミドから分離することができる。この酵素は、メチル化DNAを消化する。したがって、唯一新たに合成されたプラスミドを形質転換することができる。このチュートリアルでは、自家製の変異導入キットを使用して部位特異的突然変異誘発を行って実証した。このキットの利点は、効果がままコスト削減です。この方法の重要な点は、プライマーの設計とアニーリング温度です。場合には新たに合成されたDNAは電気泳動後に、メソッドの失敗を示す可能性がある、1つは細菌の形質転換のための全体の反応と使用して沈殿させることを試みることができる視覚化できません。しかし、この問題を解決する最善の方法は、アニーリング温度を最適化またはプライマーの定常領域の長さを増加させるとしている。さらに、高品質のポリメラーゼまたは制限酵素を使用しても反応の感度が向上する可能性があります。コンピテントセルはまた、この方法のsuccessfulnessの要因となる重要な要素です。したがって、中間の（107 CFU /μgのDNA）または高（109 CFU /μgのDNA）のコンピテントセルが好ましい。

このチュートリアルでは、自家製キットを使用して、欠失または挿入を示すしなかったが、我々の研究室でこれらを行うことに成功した。私たちは正常に同時に少なくとも3塩基を、置換、挿入または削除することができた。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pfu polymerase (recombinant or native)	Fermentas	EP0571 or EP0501
dNTP mix 10 mM	Fermentas	R0191
DpnI or DpnI Fast digest	Fermentas	ER1701
primers	Invitrogen		desalted