Mutagenèse dirigée maison des plasmides entiers

Summary

Mutagenèse dirigée de plasmides ensemble est un moyen simple de créer des variations légèrement différentes d'un plasmide d'origine. Ici nous démontrons une manière facile et rentable d'introduire des substitutions de bases dans un plasmide standard en utilisant des réactifs.

Abstract

Mutagenèse dirigée de plasmides ensemble est un moyen simple de créer des variations légèrement différentes d'un plasmide d'origine. Avec cette méthode, le gène cible clonés peuvent être modifiés par substitution, délétion ou d'insertion de quelques bases directement dans un plasmide. Il fonctionne tout simplement en amplifiant le plasmide entier, dans une réaction thermocyclage PCR non. Lors de la réaction amorces mutagènes, porteurs de la mutation souhaitée, sont intégrés dans le plasmide nouvellement synthétisé. Dans ce tutoriel vidéo, nous démontrons une manière facile et rentable d'introduire des substitutions de bases dans un plasmide. Le protocole fonctionne avec des réactifs standard et est indépendant de kits commerciaux, qui sont souvent très coûteux. L'application de ce protocole peut réduire le coût total d'une réaction à un huitième de ce qu'il en coûte en utilisant certains des kits commerciaux. Dans cette vidéo, nous avons également des commentaires sur les étapes essentielles du processus et donner des instructions détaillées sur la façon de concevoir les amorces mutagènes.

Protocol

Principe de la méthode:

La mutagenèse dirigée de plasmides entière expliqué dans cette vidéo est une méthode de mutagenèse qui vous permet de modifier un gène cible clonée par substitution, délétion ou d'insertion de quelques bases directement dans un plasmide. Il agit en amplifiant le plasmide entier, dans une réaction thermocyclage PCR non. Lors de la réaction amorces mutagènes, portant la mutation désirée sous forme d'inadéquation au plasmide d'origine, sont intégrés dans le plasmide nouvellement synthétisé. Après l'élimination du plasmide d'origine de la réaction du plasmide muté est transformé en E. coli. Les étapes suivantes sont à des fins de dépistage seulement, car l'efficacité de la mutation de cette méthode n'est pas 100%. La procédure complète prend trois jours, mais la partie principale peut être fait en une journée.

1.0 La première journée:

1.1 réaction thermocyclage:

D'origine plasmidique: Cette mutagenèse dirigée protocole qui fonctionne le mieux avec des plasmides à 10ko. Agrandir Les plasmides sont un peu difficiles à muter avec cette méthode et peut prendre un peu de patience et d'adaptation des conditions de thermocyclage et / ou de cellules compétentes. En outre, le plasmide qui vous travaillez avec doit être isolé à partir d'un barrage + souche de bactéries. Pour la réaction thermocyclage vous aurez besoin de 10 à 60 END du plasmide vous voulez muter.

Primaires: Avant que vous pouvez configurer votre réaction thermocyclage vous devez avoir vos amorces à portée de main. Vous avez besoin d'environ 150 ng de chaque primer mutagène. Il est ok, si vous prenez 1,5 pi d'une dilution 1:10 100 actions pM. Il ya quelques règles simples que vous devez tenir compte lorsque vous concevez votre amorces mutagènes:

• Les amorces devraient être complémentaires les unes aux autres
• Les amorces doivent être entre 25 et 45 nucléotides de long
• Les mutations dans la forme de l'inadéquation de la plasmide d'origine doivent être contenues dans les deux amorces
• Les décalages doivent être centrées dans l'amorce et flanqué d'au moins 8 nucléotides de chaque côté
• Les amorces doivent avoir un contenu en GC d'au moins 40%
• Les amorces devraient extrémité 5 premiers et 3 premiers avec un ou plusieurs Gs ou Cs
• Les amorces ne doivent pas être phosphorylée, et ils n'ont pas à être FPLC ou PAGE purifiée, simplement dessalée qu'ils devraient être.
• Pour le calcul de Tm vous n'avez pas besoin d'aucune formule, mais Tm sur le certificat d'expédition doit être supérieure à 60 ° C.
• À des fins de dépistage, il est pratique pour insérer ou supprimer un site de restriction avec votre mutation. En raison de la dégénérescence du code génétique il ya beaucoup de possibilités pour insérer un site de restriction avec votre mutation désirée. Le site du New England Biolabs fournit un outil pour trouver un tel site de restriction approprié. Entrez simplement votre séquence de l'amorce codant pour la séquence d'acides aminés que vous désirez, en utilisant le code d'ambiguïté pour l'ADN. L'outil de recherche d'enzymes vous dira quels sites de restriction peuvent être introduits en parallèle à votre mutation désirée. Si vous ne pouvez pas trouver tout site de restriction possible ou pratique de cette façon, vous pouvez insérer un nouveau site de restriction concernant les sans code génétique sur le site de mutation. Par la suite, vous pouvez utiliser ce plasmide comme matrice pour une série de mutations dans lequel ce site de restriction sera supprimée par l'insertion de la nouvelle amorces mutagènes. Cette approche peut être très pratique si vous avez l'intention de faire une série de mutations sur le même site du plasmide.

ADN-polymérase: Pour cette méthode, vous avez besoin d'une ADN-polymérase thermostable qui présente une activité exonucléase 3'-5 'et crée des extrémités franches. Nous utilisons toujours recombinante Pfu-polymérase du Fermentas. Si vous avez des problèmes avec les étapes d'amplification, vous pouvez essayer une polymérase de qualité supérieure, mais pour la plupart des fins de la Pfu standard sera suffisant. Remplissez la réaction avec dNTP, polymérase tampon et d'eau.

1,2 conditions thermocyclage

Le thermocycleur doit être mis en place de la façon suivante. La phase initiale de dénaturation et récurrent est réglé sur 30 sec à 95 ° C.

La température de recuit des amorces ne doivent pas être calculées avec des formules compliquées. En général, nous réglez la température de recuit à 55 ° C et le temps de recuit à une minute. Pour amorces de 25 à 30 nucléotides qui vous allez utiliser pour la plupart, cela fonctionne pour nous 95% du temps. Quoi qu'il en soit, si cela ne devrait pas travailler, essayez simplement varier la température de recuit entre 50 - et 60 ° C.

La température dépend de l'élongation de la polymérase vous utilisez. Dans cette démonstration, nous utilisons la Pfu polymérase du Fermentas, qui appelle à une température d'élongation de 72 ° C. Le temps d'élongation varie en fonction de la taille du plasmide. Nous calculons toujours 1 min par ko, et ajouter une minute supplémentaire pour que lestemps. Par exemple, pour un plasmide 9kb nous choisirions 10min que le temps d'élongation.

18 cycles sont suffisantes pour créer suffisamment muté plasmide pour l'utilisation ultérieure. Maintenir le nombre de cycles de basse, vous fait également gagner du temps.

1,3 Gelcheck après réaction thermocyclage

L'amplification de succès devrait être vérifiée en effectuant une électrophorèse. Directement après le vélo est terminée, charge de 5 ul de la réaction sur un gel à 1% d'agarose TAE. Si l'amplification a été un succès, vous devriez voir une bande distincte. Toutefois, si l'ADN nouvellement synthétisé n'est pas clairement visible sur le gel, vous pouvez essayer de précipiter toute la réaction et l'utiliser pour la transformation à l'étape suivante. Pour nous, cela a rarement travaillé, mais il vaut la peine de donner un essai. La meilleure chose à faire si la réaction ne fonctionne pas est d'ajuster la température de recuit.

1,4 digestion Dpnl:

Avant la transformation du plasmide original qui a servi de modèle doit être retiré de la réaction pour éviter de solides antécédents. Cela se fait par digestion de restriction avec Dpnl. Cette endonucléase de restriction ne coupe que méthylé plasmide. Sa reconnaissance et site de restriction est la séquence GATC alors A doit être méthylées. Lorsque la digestion avec Dpnl seul le plasmide d'origine non muté qui a été isolée à partir d'un barrage + souche est ensuite coupée, le plasmide muté nouvellement synthétisées qui n'est pas méthylé n'est pas affectée par Dpnl. Il suffit d'ajouter 1-2 ul Dpnl à la réaction et incuber c'est au moins une heure à 37 °. Lorsque vous utilisez le Fast digérer Dpnl le temps d'incubation peut être réduit à environ 15 minutes. La qualité de votre Dpnl et le temps d'incubation de cette digestion de restriction détermine grandement la force de vos antécédents avec le plasmide non muté sera.

1.5 Transformation:

Après digestion du plasmide Dpnl est prêt pour la transformation en l'autorité compétente E. cellules coli. Il suffit d'ajouter 5 ul de la réaction de digestion Dpnl dans les cellules compétentes et de réaliser la transformation tel que recommandé dans votre laboratoire. Dans notre cas, nous utilisons la procédure de choc thermique en incubant le mélange de bactéries plasmide sur la glace pendant 30 min puis choc thermique c'est à 42 ° C pendant 90 sec. Après l'ajout de 200 ul SOC-solution, les bactéries sont incubées, secouer vigoureusement, à 37 ° C pendant 1 h. Après 1 heure du bactéries sont étalées sur la sélection d'agar.

Jour deux 2,0

2.1 Dépistage d'une partie des clones 1: Sélection des clones

Parce que l'efficacité mutation n'est pas à 100% vous avez besoin de l'écran de votre mutants. Nous faisons cela par digestion de restriction dans lequel nous vérifier la présence ou l'absence de site de restriction auquel nous avons ajouté ou supprimé par l'intégration d'apprêt. A cet effet, nous avons l'habitude ramasser huit colonies et les cultiver pendant la nuit pour la préparation de plasmide sur le lendemain.

3.0 La troisième journée

3.1 Dépistage d'une partie des clones 2: digestion de restriction avec l'enzyme marqueur

Le troisième jour, vous effectuez une préparation Mini et la digestion de restriction ultérieurs avec votre marqueur enzymatique. Sur le gel vous pouvez alors voir lequel de vos clones porteurs de la mutation désirée et ceux qui pas.

La méthode de dépistage à l'aide la digestion de restriction fonctionne très bien. Néanmoins, vous devez confirmer votre mutation réussie par séquençage.

Discussion

Mutagenèse dirigée est une méthode qui mutagenèse fournit un moyen rapide de muter un gène porté par un plasmide. La réaction peut être fait tout en une seule journée. Avec cette méthode, il suffit d'une paire d'amorces complémentaires portant les mutations souhaitées et une polymérase Pfu relecture tels que-polymérase. Le plasmide nouvellement synthétisés peuvent être séparés du plasmide parental en digérant la réaction avec l'enzyme de restriction Dpnl. Cette enzyme digère l'ADN méthylé uniquement. Par conséquent, seuls le plasmide nouvellement synthétisées peuvent être transformés. Dans ce tutoriel, nous avons démontré l'exécution d'une mutagenèse dirigée en utilisant un kit de mutagenèse maison. L'avantage de ce kit est la réduction des coûts tandis que l'efficacité reste. Les points critiques de cette méthode sont la conception d'amorce et de la température de recuit. Dans le cas où l'ADN nouvellement synthétisé ne peuvent pas être visualisés après électrophorèse, ce qui peut indiquer l'échec de la méthode, on peut essayer de précipiter toute la réaction et l'utiliser pour la transformation dans les bactéries. Cependant, la meilleure façon de résoudre ce problème est d'essayer d'optimiser la température de recuit ou augmenter la longueur de la région constante dans les amorces. En outre, en utilisant une polymérase de haute qualité ou des enzymes de restriction peut également améliorer la sensibilité de la réaction. Les cellules compétentes sont également un facteur clé qui effectue la capacité de réussite de cette méthode. Ainsi les cellules du milieu (107 ufc ADN / pg) ou fortement (109 ufc ADN / pg) compétent sont préférables.

Bien que dans ce tutoriel, nous ne démontrait pas la suppression ou l'insertion en utilisant le kit de maison, nous avons réussi à faire dans nos laboratoires. Nous avons réussi à remplacer, insérer ou de supprimer au moins 3 bases en même temps.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pfu polymerase (recombinant or native)	Fermentas	EP0571 or EP0501
dNTP mix 10 mM	Fermentas	R0191
DpnI or DpnI Fast digest	Fermentas	ER1701
primers	Invitrogen		desalted