Summary
توضح هذه المقالة تقنية عالية القرار الزماني والمكاني لحركة بصريا صورة عمل محتمل على سطح قلوب الفئران باستخدام Langendorff - perfused صبغة potentiometric (دي - 8 - ANEPPS).
Abstract
أصبحت الخرائط الضوئية من سطح القلب مع الجهد حساسة الأصباغ الفلورية أداة هامة لتحقيق الإثارة الكهربائية في النماذج التجريبية التي تتراوح في نطاق من الخلايا إلى أجهزة الثقافات كلها ،
Protocol
الجزء 1 : حلول إعداد والمعزولة قلب نظام perfused
- في صباح يوم من التجربة ، على استعداد لل4.0 L - كريبس هنسلايت الحل كما هو موضح سابقا [5 ، 6].
- 11 ملمول / لتر 2،3 - butanedione يذوب monoxime (BDM) في 1.0 لتر من كريبس - هنسلايت حل يصب من سائل الإرواء أعدت في الخطوة 1.1.
- تتم إزالة إضافي 150 مل كريبس - هنسلايت من سائل الإرواء أعدت في الخطوة 1.1 و مختلطة مع 5 مول / لتر دى ANEPPS - 8 (المخفف من الأسهم ملمول / لتر 10 الذائبة في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO)).
- يتم نقل هذه الحلول من 3 إلى مياه الخزانات تغلف الزجاج (Radnoti) أين هم قبل تحسنت إلى 41.0 درجة مئوية والاوكسيجين مع عوامات المغمورة (Radnoti) باستخدام 0.2 ميكرون ، تصفية 95 ٪ O 2 ، 5 ٪ غاز ثاني أكسيد الكربون 2. ويتم ضخ الحلول من الأسهم 3 خزانات للنظام Langendorff الحائط بمضخات ™ L / S MasterFlex تمعجية وانخفاض امتصاص أنابيب السيليكون (كول ، Parmer).
- قبل التجميع ، يتم غسلها بدقة النظام Langendorff الأواني الزجاجية (Radnoti) مع E - TOXA تنظيف كاشف (سيغما الدريخ) وتشطف جيدا بنسبة 0.1 M / L حمض الهيدروكلوريك ، والإيثانول بنسبة 100 ٪ ، والماء المقطر.
- شيد جهاز Langendorff غير اعادة توزيع لتسليم 70 ملم زئبق ضغط مستمر من خزانات الاوكسيجين 3 منفصلة ، التي يتم فصلها من القلب مع لفائف تسخين المياه ، ومصائد تغلف فقاعة (Radnoti) [7]. 3 خطوط لنضح مستقلة تلتقي فوق القلب في الصمامات 3 اتجاهين ، مما يسمح لنا للسيطرة على وجه التحديد تقديم الحلول أعد الخطوات 1،1-1،3. توصيل المياه تغلف الأواني الزجاجية في سلسلة مع أنابيب MasterFlex BPT PharMed (كول ، Parmer) وتحسنت إلى 39 درجة مئوية مع الماء المقطر باستخدام اثنين المروجون E100 (اودا). أدى فقدان الحرارة عن طريق أنابيب سيليكون البلاتين الشفاء (كول ، Parmer) الذي يربط الخزانات الضغط على رئيس لفائف التدفئة والفخاخ فقاعة في 37 درجة مئوية سائل الإرواء الوصول إلى القلب.
الجزء 2 : حصاد قلب فأر وانشاء نضح Langendorff
- للحث على التخدير العام في عمق 200-250 الفئران لويس غرام ، ويتم حقن 100 ملغم / كغم من الكيتامين و 10 زيلازين ملغ / كلغ في تجويف داخل الصفاق. لهذا الخليط ، ونضيف إلى 500 U / كغ هيبارين لمنع تخثر الدم ونقص تروية عضلة القلب أثناء إجراء explantation.
- لسهولة الوصول إلى القلب والأوعية الدموية الكبرى ، وإزالة جدار الصدر الأمامي. بعد ذلك ، يتم تشريح الأنسجة المحيطة بها بعناية وفتحت كيس التامور.
- بعد التعرف على الوريد الأجوف السفلي ، وهذه السفينة مع ligated 5-0 الحرير (Ethicon) وexplanted كامل كتلة القلب والرئة. توضع فورا في الأنسجة الجليد الباردة حل كريبس - هنسلايت الواردة في دورق 50 مل على الجليد.
- يتم التعرف بسرعة والأبهر الصاعد من تشريح الأنسجة المحيطة. يتم إدخال قنية بحجم مناسب (جهاز هارفارد) في الشريان الأورطي ، مع الحرص على تجنب انقطاع التروية اجبة للشرايين التاجية عن طريق إدراج قنية بعيدا جدا في جذر الأبهر. يتم تأمين قنية إلى الشريان الأبهر الصاعد مع الحرير 5-0 (Ethicon).
- ثم وضعت في قلب فأر على الجهاز Langendorff دون إدخال فقاعات الهواء في قنية. وقد ثبت الآن إلى الوراء التروية الوعائية التاجية مع الدافئة ، والحل كريبس - هنسلايت الاوكسيجين من الرأس الضغط هو موضح في الخطوة 1.6.
- يتم الآن إزالة الأنسجة اضافية ، بما في الرئتين ، وperfused قلب لمدة 20 دقيقة للسماح لاستعادة وظيفة وتحقيق الاستقرار في الإيقاع. خلال هذا الوقت ، قدم رقيقة جدا التحقيق في درجة الحرارة الحرارية (كول ، Parmer) في تجويف البطين الأيسر وخياطة في مكان مع خياطة Prolene 5-0 (Ethicon). يرتبط التحقيق إلى وحدة تحكم حراري (DIGI - تحسس) لضمان درجة حرارة القلب هو الحفاظ على 37 درجة مئوية عن طريق ضبط إعدادات مضخات المياه في الدورة الدموية. يتم التقليل من الحركة من سائل الإرواء يقطر من ذروة القلب عن طريق وضع قطعة من الشاش في وعاء النفايات السائلة.
الجزء 3 : قلب تحميل مع صبغة potentiometric واكتساب الإشارات الضوئية وelectrographic
- تحميل دي - 8 - ANEPPS (Invitrogen) في القلب عن طريق التحول إلى السطر الذي يحتوي على نضح مختلطة كريبس - هنسلايت مع صبغة الفلورسنت باستخدام محبس. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وضع قنية 18G في الأذين الأيسر و / أو اليمين وإضافية سعة 50 مل من محلول الصبغة يدار ببطء في كل من هذه الدوائر لأنهم ليسوا perfused بما فيه الكفاية مع صبغة أدخلت عبر الشرايين التاجية.
- أثناء إجراء التحميل ، يتم وضعها بلطف 3 يؤدي ECG (جهاز هارفارد) على سطح القلب الذي لا تواجه البصريات المستخدمة لرسم الخرائط. يتم وضع قطب كهربائي N س 1 على الجزء الخلفي من قمية من البطين الأيسر ، N س 2 في الأذين الأيسر ، وN
- ECG مكبر للصوت (هوغو ساكس الكترونيك) : ضبط مرشح المرور العالي : 0.1 هرتز
انخفاض تصفية باس : 150 هرتز - يتم وضع كاميرا CMOS (RedShirt التصوير) وmacroscope باستخدام تعديلات XYZ بحيث سطح القلب هو في التركيز ، وتركزت في إطار التملك. هي التي شنت الكاميرا والبصريات على طاولة الاهتزاز العزلة (ناقص K التكنولوجيا) للحد من الترددات الرنانة. في الوقت نفسه ، مسرى إنظام المحورية (جهاز هارفارد) التي تسيطر عليها مع معزولة ، وحدة التحفيز الكهربائي - S48 (العشب) ، يتم وضعها على الأذين الأيمن وتيرة القلب في 300 نبضة في الدقيقة (الشكل 1).
- التحفيز الكهربائي (غراس) الإعدادات :
معدل : 5 نبضة في الثانية
التأخير : 0.2 مللي
المدة : 2 مللي ثانية
فولت : 6-12 V
الوضع : كرر
نبض : واحدة - التسجيلات البصرية التي تفتقر الحركة الفنية من الانكماش ، والقلب يحتاج إلى uncoupled الكتروميكانيكية. ونحن نفعل ذلك عن طريق التحول مرة أخرى إلى خطوط الارواء كريبس - هنسلايت الحل الذي يحتوي على 11 ملمول / لتر BDM. بين اقتناء perfused هو قلب نقي مع كريبس - هنسلايت للمساعدة في الحفاظ على سلامة التحضير.
- يتم تعيين المعلمات التسجيل باستخدام برنامج (التصوير RedShirt) مع ضبط حيازة التالية :
التكوين : 2000 هرتز ؛ 128x128 بكسل صفيف
الإطار الزمني : 0.5 مللي
الكاميرا كسب مكبر للصوت : 5X
على رقاقة التغابن : 8X - 12Me رفاه
مصراع : 500 مللي تأخير
عدد من إطارات : 4000
المدة : 2000 مللي - يتم تشغيل كل غرفة الأضواء والمعدات الخروج أو محمية للقضاء على الضوضاء الخلفية أثناء التسجيل. ضوء LED يضيء القلب فقط أثناء تسجيل الضوئية للحد من الصور وسمية تبييض صباغة. يتم التحكم في مصراع مصدر الضوء مع نبض الخامس 5 تسليمها خلال لوحة التحكم عن طريق لD - A - لوحة في الكمبيوتر (التصوير RedShirt).
الجزء 4 : تحليل المعلومات باستخدام RedShirt اقتناء برامج التصوير
- بعد عملية الاستحواذ ، تتم معالجة البيانات باستخدام إعدادات التصفية مختلفة. نحن عادة استخدام الإعدادات الافتراضية إلا عند ضبط حزام إيقاف / تمرير التصفية ، التي تم تعيين الحدود مع اليسار في حدود 44.0 و 98.0 في الحق. بعد ذلك تتم معالجة المعلومات المسجلة ويتم إنشاء الفيلم (التصوير RedShirt).
- البيانات من اقتناء يناظر التنشيط الكهربائي المحلية على 16384 مواقع على سطح القلب على مدى فترة من 2 ثانية. برنامج يسمح لهذه الإشارات المحلية مقارنة مباشرة مع بعضها البعض ومع التسجيلات electrographic الأذيني البطيني و. ثم تصور البيانات بواسطة تعيين التنشيط الكهربائي المحلي للون وتقديم هذه المعلومات للرسوم المتحركة تظهر تفعيل spatiotemporal الكهربائية على سطح القلب. لخلق مثل هذه الرسوم المتحركة ، ونحن نستخدم البرنامج إلى :
- الزمان و / أو تصفية البيانات مكانيا
- تحديد وقت البدء والنهاية للرسوم المتحركة
- الإشارات الضوئية للون الخريطة على أساس كثافة الضوء يستريح كل بكسل
- تراكب البيانات اللون الناتج مع صورة للقلب
- إنشاء الصور المتحركة
الجزء 5 : نتائج الممثل
إذا كان إعداد القلب perfused حراك أثناء التسجيل ، والإشارات الضوئية تظهر قمة واحدة متميزة عن كل بكسل تشارك في تغيير كثافة انبعاث ثنائي ANEPPS - 8. الأفلام المقابلة (الشكلان 3 و 4) إثبات وجود جبهة موجة الإثارة نشر عبر سطح epicardial للقلب وكذلك تسجيلات حصلت في وقت واحد electrographic (الشكل 2).
الشكل 1. صورة فوتوغرافية لإعداد قلب Langendorff - perfused تصور مواقف الكهربائي على سرعة الأذين الأيمن وتخطيط القلب ويؤدي كما هو موضح في الخطوة 3.2.
الشكل 2. الإشارات الضوئية الممثل والتسجيلات electrographic من قلب فأر perfused لويس. لوحة ويظهر صورة لسطح epicardial المستخدمة في التصوير الضوئي. يشار إلى موقف البيكسل المحددة لإظهار التغيرات في الانبعاثات على مر الزمن في مضان باء الفريق من السهام الملونة. وترد إشارات في C Electrographic الفريق مع الخط الأحمر يشير إلى تنشيط الأذيني والخط الأزرق الفاتح المقابلة للإشارة البطين. من فضلكve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg "> انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يجب تنفيذ إزالة القلب من تخدير الفئران بسرعة لتجنب نقص تروية عضلة القلب. إذا نقص التروية أو عدم كفاية التروية التاجية يحدث ذلك ، فإن عدم انتظام ضربات القلب وتطوير المرجح أن تصبح احتشاء. بالإضافة إلى ذلك ، سوف تظهر هذه الانبعاثات قلوب مضان كافية لتسجيلات بالمعلومات والتحليلات اللاحقة. قبل تحميل الصبغة ، وخلايا عضلة القلب يجب أن يتم على نحو كاف مع perfused كريبس - هنسلايت حل لإنشاء والحفاظ على الوسط بالكهرباء فيزيولوجي لاستقرار نبضات كهربائية. إعداد دقيق للسائل الإرواء ضروري أيضا للحفاظ على سلامة الجهاز المناسب والوظيفة. والاختلافات في تركيز الكهارل أو تصفية كافية من سائل الإرواء تؤدي على الأرجح إلى ضعف عضلة القلب القاتلة واضطرابات إيقاع القلب. لالتسجيلات البصرية ، لا بد من تحميل القلب تماما مع الجهد حساسة للصباغة. وهذا أمر مهم خاصة بالنسبة للعضلة القلب الأذيني كما لم تكن هذه الغرف جيدا perfused من الشرايين التاجية. لقد وجدنا أن إضافية داخل جوفي نضح من الأذينين ستنشئ اشارة جيدة البصرية. وعلاوة على ذلك ، واقتناء اقتفاء أثر الجهد عالية الجودة يتطلب قلب perfused أن يكون بلا حراك ، وإلا ، لا يمكن أن التغيرات في الانبعاثات مضان استخدامها بشكل صحيح لتتبع التغيرات في غشاء المحتملة مع الدقة العالية بسبب الآثار الناجمة عن الانجراف الإشارة. وهذا سيؤدي في قمم متعددة لبكسل واحد بدلا من ذروة واحدة. طرق أخرى للقضاء على الحركة الفنية من التسجيلات البصرية وتشمل تجميد الميكانيكية والمعاملة مع uncouplers الإثارة ، تقلص أخرى (مثل مثبط حركة الخلايا D ، blebbistatin) ، معالجة الإشارات ، والنمذجة الرياضية [1 ، 8]. أخيرا ، وصفت الأسلوب هنا لا يقدم سوى معلومات بشأن عمل محتمل الحركة على سطح epicardial القلب. قد الاستعدادات الأنسجة البديلة والأصباغ الحمراء potentiometric حل خصائص الانتشار الكهربائية في مناطق أخرى من القلب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها المؤسسات ورعاية الحيوان اللجنة استخدم في مستشفى بوسطن للأطفال.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل عن طريق المنح البحثية من المعاهد الوطنية للصحة (HL068915 ؛ HL088206) والمساهمات للصندوق التوصيل القلب في مستشفى بوسطن للأطفال.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CardioCMOS-SM128f | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| CardioPlex Software | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| LUXEON LED Light Source 460-490 nm | Equipment | Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA | LXHL-PB02 | |
| ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik | Equipment | Harvard Apparatus | 730149 | |
| Dichroic Mirror 505 nm | Equipment | Semrock | FF505-SDi01-25x36 | |
| Emission Filter 605 nm Long Pass | Equipment | SciMedia | ||
| THT Sideways | Equipment | SciMedia | 25 BM-8 | |
| Mini Ball Joint Holder | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0177 | |
| Small Stimulation Electrode Set | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0160 | |
| BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform | Equipment | Technology Inc., Inglewood, CA 90301 | 25 BM-6 | |
| Monopolar ECG Electrode | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0200 | |
| Roller Pump SCI 400 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 401U/D1 | |
| Roller Pump MasterFlex Easy Load II | Equipment | Cole-Parmer | Model 77201-60 | |
| Tubing Marprene #14 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 902.0016.016 | |
| MasterFlex Tubing | Equipment | PharMed, Westlake, OH 44145 USA | 06485-25 | |
| S48 Square Pulse Stimulator | Equipment | Grass Technologies | Model S48 | |
| SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT | Equipment | Grass Technologies | Model SIU5 | |
| 5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-5 | |
| 2 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-2 | |
| 0.5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-0 | |
| 0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-025 | |
| 10 ml Heating Coil | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 158822 | |
| Compliance Bubble Trap | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 130149 | |
| Luer Disconnect Cannula | Equipment | Harvard Apparatus | 72-1444 | |
| 3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 72-2630 | |
| Thermocouple Thermometer | Equipment | Cole-Parmer | WU-91100-40 | |
| Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe | Equipment | PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA | IT-24P | |
| Oscilloscope Tektronix TDS 1002 | Equipment | Tektronix, Inc. | TDS 1002B | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Reagent | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Ketamine HCl | Reagent | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Xylazine | Reagent | Lloyd, Inc. | LB15705A | |
| E-TOXA-CLEAN® | Reagent | Sigma-Aldrich | E9029 | |
| Di-8-ANEPPS | Reagent | Invitrogen | D-3167 |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G.
- Hucker, W. J. Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction. Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).
- Entcheva, E. Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system. IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).
- Stamm, C. Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha. Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Skrzypiec-Spring, M. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
