Summary
Cet article décrit une technique de haute résolution spatiale et temporelle optiquement l'image mouvement d'action potentielle sur la surface de coeurs de rats perfusés de Langendorff en utilisant un colorant potentiométrique (di-8-ANEPPS).
Abstract
Cartographie optique de la surface cardiaque avec sensibles au voltage colorants fluorescents est devenu un outil important pour étudier l'excitation électrique dans des modèles expérimentaux qui vont à l'échelle de cultures de cellules d'organes entiers
Protocol
Partie 1: Préparer les solutions et le système coeur isolé perfusé
- Le matin de l'expérience, L 4,0 de Krebs-Henseleit solution est préparée comme décrit précédemment [5, 6].
- 11 mmol / L 2,3-butanedione monoxime (BDM) est dissous dans 1,0 L de Krebs-Henseleit solution décantée du perfusat préparé à l'étape 1.1.
- Un montant supplémentaire de 150 ml de Krebs-Henseleit est retiré de la perfusat préparé à l'étape 1.1 et mélangé avec 5 mol / L di-8-ANEPPS (dilué à partir d'un 10 mmol / L des stocks dissous dans le diméthylsulfoxyde (DMSO)).
- Ces trois solutions sont transférés à chemise d'eau en verre réservoirs (Radnoti) où ils sont pré-chauffé à 41,0 ° C et oxygéné avec un bulleur submergé (Radnoti) à l'aide de 0,2 um-filtrée à 95% d'O 2; 5% de CO 2 gazeux. Solutions à partir des 3 réservoirs de stock sont pompés vers le système mural de Langendorff avec Masterflex ™ L / S pompes péristaltiques et de faible absorption de tube en silicone (Cole-Parmer).
- Avant le montage, le système de Langendorff verrerie (Radnoti) est méticuleusement lavées avec E-TOXA-CLEAN réactif (Sigma-Aldrich) et rincés à fond avec 0,1 M / L HCl, 100% d'éthanol et d'eau distillée.
- L'appareil de Langendorff sans recirculation a été construit pour fournir 70 mm Hg à pression constante de 3 réservoirs séparés oxygénée, qui sont séparés du cœur avec les serpentins de chauffage à chemise d'eau et les pièges à bulles (Radnoti) [7]. Les trois lignes de perfusion indépendantes convergent au-dessus du coeur à deux robinets à 3 voies, nous permettant de contrôler précisément la livraison des solutions préparées dans les étapes 1.1 à 1.3. Chemise d'eau verrerie est connecté en série avec tube MASTERFLEX BPT PharMed (Cole-Parmer) et chauffé à 39 ° C avec de l'eau distillée en utilisant deux circulateurs E100 (Lauda). La perte de chaleur par le tube de silicone traité au platine (Cole-Parmer) qui relie les réservoirs à pression tête pour les serpentins de chauffage et de pièges à bulles abouti à un 37 ° C perfusat d'atteindre le coeur.
Partie 2: Récolte du coeur de rat et de mettre en place une perfusion de Langendorff
- Pour provoquer une profonde anesthésie générale dans 200 à 250 g chez le rat Lewis, 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine est injecté dans la cavité péritonéale. A ce mélange, on ajoute 500 U / kg d'héparine pour éviter la coagulation du sang et l'ischémie myocardique durant la procédure d'explantation.
- Pour un accès facile vers le cœur et gros vaisseaux, la paroi thoracique antérieure est retirée. Après cela, les tissus environnants est soigneusement disséquée et le sac péricardique ouvert.
- Après identification de la veine cave inférieure, ce navire est ligaturé avec de la soie 5-0 (Ethicon) et de l'ensemble cœur-poumon bloc est explanté. Tissulaire est immédiatement placé dans glacée de Krebs-Henseleit solution contenue dans un bécher de 50 ml sur la glace.
- L'aorte ascendante est rapidement identifié et disséqué par les tissus environnants. Une taille appropriée canule (Harvard Apparatus) est inséré dans l'aorte, en prenant soin d'éviter d'interrompre la perfusion obligatoire des artères coronaires en insérant la canule trop loin dans la racine aortique. La canule est fixée au aorte ascendante avec de la soie 5-0 (Ethicon).
- Le coeur de rat est alors placé sur l'appareil de Langendorff sans introduire de bulles d'air dans la canule. Rétrograde perfusion coronaire vasculaire est désormais établi avec la chaleur, oxygénée de Krebs-Henseleit solution à partir de la pression de tête décrite à l'étape 1.6.
- Tissulaire supplémentaire, y compris les poumons, est désormais supprimé et le coeur est perfusé pendant 20 minutes afin de permettre la récupération de la fonction et à stabiliser le rythme. Pendant ce temps, une sonde de température très mince thermocouple (Cole-Parmer) est introduit dans la cavité ventriculaire gauche et suturé en place avec 5-0 Prolène suture (Ethicon). La sonde est reliée à un thermo-régulateur (Digi-Sense) pour s'assurer que la température du cœur est maintenue à 37 ° C en ajustant les paramètres de la pompe de circulation d'eau. Motion à partir perfusat dégoulinant de l'apex cardiaque est minimisé en plaçant un morceau de gaze dans le récipient d'effluents.
Partie 3: coeur de charge avec un colorant potentiométrique et d'acquérir des signaux électroencéphalographiques et optiques
- Di-8-ANEPPS (Invitrogen) est chargé dans le cœur par le passage à la ligne de perfusion contenant le mélange de Krebs-Henseleit avec le colorant fluorescent à l'aide d'un robinet. De plus, une canule 18G est placé dans l'oreillette gauche et / ou à droite et 50 ml supplémentaires de solution de colorant est lentement administré dans chacune de ces chambres, car ils ne sont pas suffisamment perfusé avec un colorant introduit dans les artères coronaires.
- Pendant la procédure de chargement, 3 dérivations (Harvard Apparatus) sont délicatement placés sur la surface du cœur qui n'est pas face à l'optique utilisée pour la cartographie. Electrode n o 1 est positionné sur la partie postérieure apicale du ventricule gauche, n o 2 sur l'oreillette gauche, et N
- ECG amplificateur (Hugo Sachs Elektronik) paramètres: Filtre passe-haut: 0,1 Hz
Filtre passe-bas: 150 Hz - La caméra CMOS (redshirt Imaging) et macroscope est positionné en utilisant les réglages XYZ afin que la surface du cœur est au point et centré dans le cadre d'acquisition. La caméra et l'optique sont montés sur une table anti-vibrations (Minus K Technology) afin de minimiser les fréquences de résonance. Dans le même temps, la stimulation d'une électrode coaxiale (Harvard Apparatus) contrôlé par un cas isolé, S48-stimulation électrique unitaire (herbe), est placé sur l'oreillette droite et le cœur est au rythme de 300 battements par minute (figure 1).
- Stimulation électrique (Grass) paramètres:
Tarif: 5 impulsions par seconde
Délai: 0,2 ms
Durée: 2 ms
Volts: 6-12 V
Mode: Répéter
Pulse: Simple - Pour les enregistrements optiques qui manquent les artefacts de mouvement de la contraction, le cœur doit être découplée électromécanique. Nous faisons cela en commutation à nouveau les lignes de perfusion de Krebs-Henseleit solution qui contient 11 mmol / L BDM. Entre les acquisitions, le coeur est perfusé avec inaltérée de Krebs-Henseleit pour aider à préserver la viabilité de la préparation.
- Les paramètres d'enregistrement sont fixés à l'aide du logiciel (imagerie redshirt) avec les paramètres d'acquisition suivants:
Configuration: 2000 Hz; 128x128 matrice de pixels
Intervalle de trame: 0,5 ms
Gain Amplificateur Appareil photo: 5x
On-Chip Gain: 8x-12m ² bien-
Obturateur: 500 ms de retard
Nombre de cadres: 4000
Durée: 2000 ms - Toutes les lumières de la pièce et les équipements sont hors tension ou blindés pour éliminer le bruit de fond pendant l'enregistrement. La lumière s'allume au coeur uniquement pendant l'enregistrement optique de réduire la photo-blanchiment et la toxicité de teinture. L'obturateur source de lumière est contrôlée avec une impulsion de 5 V livré via le panneau de contrôle au moyen d'un D-à-Un conseil à l'ordinateur (imagerie redshirt).
Partie 4: Analyser les informations d'acquisition à l'aide du logiciel d'imagerie redshirt
- Suite à l'acquisition, les données sont traitées en utilisant différents paramètres de filtre. Nous utilisons généralement les paramètres par défaut sauf si l'ajustement de la bande d'arrêt / filtre passe, qui est fixé avec la limite à gauche à 44,0 et la limite à droite à 98,0. Plus tard, les informations enregistrées sont traitées et un film est généré (imagerie redshirt).
- Les données provenant d'une acquisition correspond à l'activation locale électrique à 16 384 sites sur la surface du coeur sur une période de 2 secondes. Le logiciel permet à ces signaux locaux d'être directement comparés entre eux et avec les enregistrements électroencéphalographiques auriculaire et ventriculaire. Les données sont ensuite visualisées par une cartographie locale activation électrique de la couleur et le rendu cette information comme une animation montrant l'activation spatio-temporelle électrique sur la surface cardiaque. Pour créer une telle animation, nous utilisons le logiciel pour:
- temporellement et / ou filtrer les données spatialement
- Sélectionnez une heure de début et de fin pour l'animation
- signaux optiques carte de la couleur selon l'intensité lumineuse de chaque pixel de repos
- superposer les données couleur résultante avec une image du cœur
- générer l'animation
Partie 5: Les résultats représentatifs
Si la préparation du cœur perfusé était immobile pendant l'enregistrement, les signaux optiques montrent un pic distinct pour chaque pixel impliqués dans un changement de l'intensité des émissions de di-8-ANEPPS. Les films correspondants (Figures 3 et 4) montrent un front d'onde d'excitation se propager sur toute la surface épicardique du cœur ainsi que les enregistrements électroencéphalographiques acquises simultanément (Figure 2).
Figure 1. Une photographie d'une préparation de Langendorff perfusé coeur illustrant les positions de l'électrode de stimulation sur l'oreillette droite et l'ECG conduit comme décrit dans l'étape 3.2.
Figure 2. Représentant des signaux optiques et des enregistrements électroencéphalographiques d'un coeur de rat perfusé Lewis. Le panneau A montre une image de la surface épicardique utilisés pour l'imagerie optique. La position des pixels choisis pour démontrer les changements dans l'émission de fluorescence au cours du temps dans le groupe B sont indiquées par des flèches colorées. Signaux électroencéphalographiques sont présentés dans le Panneau de C avec la ligne rouge indiquant l'activation auriculaire et la ligne de lumière bleue qui correspond au signal ventriculaire. S'il vous plaîtve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg "> cliquez ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
L'ablation du cœur de rats anesthésiés doivent être effectués rapidement pour éviter une ischémie myocardique. Si la perfusion d'ischémie coronarienne ou insuffisance se produit, le coeur se développeront probablement des arythmies et peut devenir un infarctus. En outre, ces coeurs montrera insuffisante émission de fluorescence pour les enregistrements informatifs et des analyses ultérieures. Avant de charger le colorant, les cellules du myocarde doivent être adéquatement perfusés avec une solution de Krebs-Henseleit à établir et maintenir un milieu électrolyte physiologiques pour la stabilité des impulsions électriques. Préparation précise de l'perfusat est également nécessaire pour maintenir la viabilité des organes et la fonction. Les différences dans la concentration d'électrolytes ou de filtrage insuffisant des perfusat va probablement conduire à un dysfonctionnement du myocarde fatal et troubles du rythme cardiaque. Pour les enregistrements optiques, le cœur doit être complètement chargée avec une tension colorant sensible. Ceci est particulièrement important pour l'auriculaire myocarde que ces chambres ne sont pas bien perfusé par les artères coronaires. Nous avons constaté que d'autres intracavitaire perfusion des oreillettes établira un bon signal optique. Par ailleurs, l'acquisition de tracés de tension de haute qualité nécessite le coeur perfusé d'être immobile, sinon, des changements dans l'émission de fluorescence ne peut pas être utilisé de manière fiable pour suivre l'évolution du potentiel de membrane avec une grande fidélité due à des artefacts causés par la dérive du signal. Cela se traduira par des pics multiples pour un pixel, plutôt que d'un seul pic. D'autres méthodes pour éliminer les artefacts de mouvement à partir d'enregistrements optiques comprennent immobilisation mécanique, le traitement avec d'autres excitation-contraction découpleurs (par exemple la cytochalasine D, blebbistatin), traitement du signal, et par la modélisation mathématique [1, 8]. Enfin, la méthode décrite ici fournit uniquement des informations concernant les mouvements d'action potentielle sur la surface épicardique cardiaques. Préparations de tissus de remplacement et l'infrarouge colorants potentiométrique peut résoudre les caractéristiques de propagation électrique dans d'autres régions du cœur.
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Disclosures
Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation à l'Hôpital pour enfants de Boston.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par des subventions de recherche du National Institutes of Health (HL068915; HL088206) et les contributions au Fonds de la conduction cardiaque au Centre hospitalier pour enfants de Boston.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CardioCMOS-SM128f | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| CardioPlex Software | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| LUXEON LED Light Source 460-490 nm | Equipment | Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA | LXHL-PB02 | |
| ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik | Equipment | Harvard Apparatus | 730149 | |
| Dichroic Mirror 505 nm | Equipment | Semrock | FF505-SDi01-25x36 | |
| Emission Filter 605 nm Long Pass | Equipment | SciMedia | ||
| THT Sideways | Equipment | SciMedia | 25 BM-8 | |
| Mini Ball Joint Holder | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0177 | |
| Small Stimulation Electrode Set | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0160 | |
| BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform | Equipment | Technology Inc., Inglewood, CA 90301 | 25 BM-6 | |
| Monopolar ECG Electrode | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0200 | |
| Roller Pump SCI 400 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 401U/D1 | |
| Roller Pump MasterFlex Easy Load II | Equipment | Cole-Parmer | Model 77201-60 | |
| Tubing Marprene #14 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 902.0016.016 | |
| MasterFlex Tubing | Equipment | PharMed, Westlake, OH 44145 USA | 06485-25 | |
| S48 Square Pulse Stimulator | Equipment | Grass Technologies | Model S48 | |
| SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT | Equipment | Grass Technologies | Model SIU5 | |
| 5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-5 | |
| 2 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-2 | |
| 0.5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-0 | |
| 0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-025 | |
| 10 ml Heating Coil | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 158822 | |
| Compliance Bubble Trap | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 130149 | |
| Luer Disconnect Cannula | Equipment | Harvard Apparatus | 72-1444 | |
| 3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 72-2630 | |
| Thermocouple Thermometer | Equipment | Cole-Parmer | WU-91100-40 | |
| Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe | Equipment | PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA | IT-24P | |
| Oscilloscope Tektronix TDS 1002 | Equipment | Tektronix, Inc. | TDS 1002B | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Reagent | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Ketamine HCl | Reagent | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Xylazine | Reagent | Lloyd, Inc. | LB15705A | |
| E-TOXA-CLEAN® | Reagent | Sigma-Aldrich | E9029 | |
| Di-8-ANEPPS | Reagent | Invitrogen | D-3167 |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G.
- Hucker, W. J. Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction. Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).
- Entcheva, E. Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system. IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).
- Stamm, C. Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha. Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Skrzypiec-Spring, M. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
