Summary
En este artículo se describe una técnica de alta resolución temporal y espacial de la imagen ópticamente movimiento de acción potencial en la superficie de los corazones de rata Langendorff perfundidos con un tinte potenciométrica (di-8-ANEPPS).
Abstract
Mapeo óptico de la superficie cardíaca con sensibles al voltaje tintes fluorescentes se ha convertido en una herramienta importante para investigar la excitación eléctrica en modelos experimentales que van en escala de cultivos de células de órganos de todo el
Protocol
Parte 1: Preparar las soluciones y el sistema de corazón aislado perfundido
- En la mañana del experimento, 4,0 L de Krebs-Henseleit solución se prepara como se describió previamente [5, 6].
- 11 mmol / l 2,3-butanodiona monoxima (BDM) se disuelve en 1.0 L de Krebs-Henseleit solución decantada de la perfusión preparada en la etapa 1.1.
- Un adicional de 150 ml de Krebs-Henseleit se retira de la perfusión preparada en el paso 1.1 y se mezcla con 5 mol / l di-8-ANEPPS (diluido en un 10 mmol / L de valores disuelto en dimetilsulfóxido (DMSO)).
- Estas tres soluciones se transfiere al agua con camisa de vidrio embalses (Radnoti), donde se pre-calentado a 41,0 ° C y oxigenada con un pelele sumergida (Radnoti) con 0,2 m con filtro de 95% O 2, 5% de CO 2 gas. Las soluciones de los tres depósitos de valores se bombea al sistema de pared con Langendorff Masterflex ™ L / S y las bombas peristálticas de baja absorción de tubo de silicona (Cole-Parmer).
- Antes del montaje, el sistema de Langendorff cristalería (Radnoti) está cuidadosamente lavadas con E-TOXA-CLEAN reactivo (Sigma-Aldrich) y enjuagar con 0,1 M / L HCl, 100% de etanol y agua destilada.
- El aparato no recirculación Langendorff fue construido para ofrecer 70 mm Hg de presión constante de 3 depósitos separados oxigenada, que están separados desde el corazón de serpentines de calefacción camisa de agua y trampas de burbujas (Radnoti) [7]. Las 3 líneas independientes de perfusión convergen por encima del corazón en dos llaves de paso de 3 vías, lo que nos permite controlar con precisión la entrega de las soluciones preparadas en pasos de 1,1 a 1,3. Con camisa de agua de vidrio se conecta en serie con un tubo Masterflex BPT PharMed (Cole-Parmer) y se calienta a 39 ° C con agua destilada con dos circuladores E100 (Lauda). La pérdida de calor a través del tubo de silicona curada con platino (Cole-Parmer) que conecta los yacimientos carga de presión a los serpentines de calefacción y trampas de burbujas como resultado un 37 º C perfundido llegar al corazón.
Parte 2: Cosecha del corazón de rata y puesta en marcha de perfusión Langendorff
- Para inducir la anestesia general profunda en ratas 200-250 g Lewis, 100 mg / kg de ketamina y xilacina 10 mg / kg se inyecta en la cavidad intraperitoneal. A esta mezcla, se añaden 500 U / kg de heparina para prevenir la coagulación de la sangre y la isquemia miocárdica durante el procedimiento de explantación.
- Para facilitar el acceso al corazón y grandes vasos, la pared anterior del tórax se ha eliminado. Después de eso, el tejido circundante se diseca cuidadosamente y abrió el saco pericárdico.
- Tras la identificación de la vena cava inferior, este vaso se liga con seda 5-0 (Ethicon) y todo el bloque corazón-pulmón explantado es. El tejido se coloca inmediatamente en helado de Krebs-Henseleit solución contenida en un vaso de 50 ml en hielo.
- La aorta ascendente es rápidamente identificado y disecado de los tejidos circundantes. Una cánula de tamaño adecuado (Harvard Apparatus) se inserta en la aorta, teniendo cuidado de evitar la interrupción de la perfusión obligatoria de las arterias coronarias mediante la inserción de la cánula demasiado lejos en la raíz aórtica. La cánula se asegura a la aorta ascendente con 5-0 seda (Ethicon).
- El corazón de rata se coloca en el aparato Langendorff sin introducir burbujas de aire dentro de la cánula. Retrógrada perfusión vascular coronaria se ha establecido con la cálida y oxigenada de Krebs-Henseleit solución de la presión de cabeza se describe en el paso 1.6.
- Tejido extra, incluyendo los pulmones, ahora se retira y el corazón se perfundidos durante 20 minutos para permitir la recuperación de la función y estabilizar el ritmo. Durante este tiempo, una sonda de temperatura termopar muy delgado (Cole-Parmer) se introduce en la cavidad del ventrículo izquierdo y se sutura en su lugar con 5-0 Prolene sutura (Ethicon). La sonda está conectada a un termo-regulador (Digi-Sense) para asegurar la temperatura del corazón se mantiene a 37 ° C mediante el ajuste de la configuración de las bombas de agua circulatorio. Movimiento de perfusión que gotea de la punta cardiaca se reduce al mínimo mediante la colocación de una gasa en el receptáculo de efluentes.
Parte 3: el corazón de carga con el tinte potenciométrica y adquirir señales electroencefalográficas y ópticas
- Di-8-ANEPPS (Invitrogen) se carga en el corazón por el cambio a la línea de perfusión que contiene la mezcla de Krebs-Henseleit con el colorante fluorescente utilizando una llave de paso. Además, una cánula de 18G se coloca en la aurícula izquierda y / oa la derecha y otros 50 ml de solución de colorante es administrado lentamente en cada una de estas cámaras, ya que no están lo suficientemente preservados con medio de contraste introducido a través de las arterias coronarias.
- Durante el procedimiento de carga, 3 derivaciones del ECG (Harvard Apparatus) se coloca suavemente sobre la superficie del corazón, que no se enfrenta a la óptica utilizada para el mapeo. Electrodo n º 1 se coloca en la parte posterior apical del ventrículo izquierdo, N ° 2 en la aurícula izquierda, y N
- Amplificador de ECG (Hugo Sachs Elektronik) opciones: filtro de paso alto: 0,1 Hz
Filtro de paso bajo: 150 Hz - La cámara CMOS (camisa roja de imagen) y macroscópico se coloca con los ajustes XYZ para que la superficie del corazón está enfocada y centrada en el marco de la adquisición. La cámara y la óptica están montadas sobre una mesa de aislamiento de vibración (menos K Technology) para reducir al mínimo las frecuencias de resonancia. Al mismo tiempo, un electrodo de estimulación coaxial (Harvard Apparatus), controlada con un hecho aislado, S48-estimulación eléctrica de la unidad (hierba), se coloca en la aurícula derecha y el corazón es un ritmo de 300 pulsaciones por minuto (Figura 1).
- La estimulación eléctrica (hierba) la configuración:
Precio: 5 pulsos por segundo
Demora: 0,2 ms
Duración: 2 ms
V: 6-12 V
Modo: Repita
Pulso: Single - Para las grabaciones ópticas que carecen de los artefactos de movimiento de contracción, el corazón tiene que ser electromecánico acoplado. Esto lo hacemos de nuevo el cambio de líneas de perfusión Krebs-Henseleit solución que contiene 11 mmol / L BDM. Entre las adquisiciones, el corazón es puro perfundidos con Krebs-Henseleit para ayudar a preservar la viabilidad de la preparación.
- Los parámetros de grabación se establecen con el software (Imagen camisa roja) con la configuración de la adquisición de lo siguiente:
Configuración: 2.000 Hz; 128x128 píxeles que
Intervalo de fotogramas: 0,5 ms
Cámara de ganancia del amplificador: 5 veces
On-Chip de ganancia: 8x-12m-, así
Obturador: 500 ms retraso
Número de fotogramas: 4000
Duración: 2000 ms - Todas las luces de la sala y los equipos están apagados o protegidos para eliminar el ruido de fondo durante la grabación. La luz ilumina el corazón sólo durante la grabación óptica para reducir el foto-blanqueo y tinte de toxicidad. El obturador fuente de luz es controlado con un pulso de 5 V entrega a través del panel de control a través de una D a un tablero en el ordenador (Imagen camisa roja).
Parte 4: Analizar la información utilizando el software de adquisición de imágenes de camisa roja
- Tras la adquisición, los datos se procesan utilizando diferentes configuraciones de filtros. Por lo general, utilizar la configuración predeterminada, excepto cuando se ajusta la banda de parada / filtro de paso, que se encuentra con el límite a la izquierda en 44.0 y el límite a la derecha en 98.0. Después de la información registrada es procesada y una película se genera (Imagen camisa roja).
- Los datos de una adquisición se corresponde con la activación eléctrica local en 16.384 sitios en la superficie del corazón durante un período de 2 segundos. El software permite que estas señales locales para ser comparados directamente entre sí y con las grabaciones electroencefalográficas auriculares y ventriculares. Datos se visualizan mediante la asignación de la activación eléctrica local a color y la representación de esta información como una animación que muestra la activación espacio-temporal eléctrica en la superficie cardíaca. Para crear este tipo de animación, que utilizará el software para:
- temporal y / o filtrar los datos espacialmente
- seleccionar una hora de inicio y fin de la animación
- mapa de señales ópticas a color en función de la intensidad de la luz en reposo de cada píxel
- superposición de los datos de color con una imagen del corazón
- generar la animación
Parte 5: Los resultados representativos
Si la preparación del corazón perfused estaba inmóvil durante la grabación, las señales ópticas muestran un pico distinto para cada pixel implicados en un cambio de la intensidad de las emisiones de di-8-ANEPPS. Las películas correspondientes (Figuras 3 y 4) muestran un frente de onda de excitación se propagan a través de la superficie epicárdica del corazón, así como las grabaciones de adquisición simultánea electroencefalográficas (Figura 2).
Figura 1. Una fotografía de una preparación de corazón Langendorff perfundidos que representan las posiciones de los electrodos de estimulación en la aurícula derecha y el ECG conduce como se describe en el paso 3.2.
Figura 2. Representante de las señales ópticas y grabaciones electroencefalográficas de un corazón de rata perfundido Lewis. El panel A muestra una imagen de la superficie del epicardio utilizados para obtener imágenes ópticas. La posición de los píxeles seleccionados para demostrar los cambios en la emisión de fluorescencia con el tiempo en el Panel B se indican con flechas de colores. Señales electroencefalográficas se muestran en el panel de C con la línea roja que indica la activación auricular y la línea azul que corresponde a la señal ventricular. Por favor,ve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg "> haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
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Discussion
La extracción del corazón de ratas anestesiadas debe realizarse rápidamente para evitar la isquemia miocárdica. Si la perfusión de la isquemia o insuficiencia coronaria se produce, el corazón es probable que desarrollar arritmias y puede llegar a ser del infarto. Además, estos corazones se muestran insuficientes emisión de fluorescencia de las grabaciones de información y los análisis posteriores. Antes de cargar el medio de contraste, las células del miocardio deben ser adecuadamente preservados con solución de Krebs-Henseleit a establecer y mantener un medio electrolítico fisiológicos para la estabilidad de los impulsos eléctricos. Preparación precisa de la perfusión también es necesario para mantener la viabilidad de órganos y funcionamiento. Las diferencias en la concentración de electrolitos o de filtrado insuficiente de la perfusión probablemente dará lugar a la disfunción de miocardio no fatal y los trastornos del ritmo cardíaco. Para las grabaciones ópticas, el corazón debe estar completamente cargado de tintes sensibles al voltaje. Esto es especialmente importante para el miocardio auricular ya que estas cámaras no están bien perfundido por las arterias coronarias. Hemos encontrado que otros dentro de la cavidad de perfusión de las aurículas se establecerá una buena señal óptica. Además, la adquisición de los trazados de voltaje de alta calidad requiere que el corazón perfundido a estar inmóvil, de lo contrario, los cambios en la emisión de fluorescencia no puede ser fiable para detectar los cambios en el potencial de membrana de alta fidelidad debido a los artefactos causados por la deriva de la señal. Esto dará lugar a múltiples picos de un pixel en vez de un solo pico. Otros métodos para eliminar los artefactos de movimiento de las grabaciones ópticas incluyen la inmovilización mecánica, el tratamiento con otros desacopladores de excitación-contracción (por ejemplo, citocalasina D, blebbistatin), procesamiento de señales, y por los modelos matemáticos [1, 8]. Finalmente, el método descrito aquí sólo proporciona información sobre el movimiento del potencial de acción en la superficie epicárdica cardíaco. Preparaciones alternativas de tejidos y tintes infrarrojos potenciométrica puede resolver las características de propagación eléctrica en otras regiones del corazón.
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Disclosures
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por el Cuidado de Animales institucional y el empleo en el Hospital de Niños de Boston.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por becas de investigación de los Institutos Nacionales de Salud (HL068915; HL088206) y las contribuciones al Fondo de conducción cardiaca en el Hospital de Niños de Boston.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CardioCMOS-SM128f | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| CardioPlex Software | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| LUXEON LED Light Source 460-490 nm | Equipment | Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA | LXHL-PB02 | |
| ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik | Equipment | Harvard Apparatus | 730149 | |
| Dichroic Mirror 505 nm | Equipment | Semrock | FF505-SDi01-25x36 | |
| Emission Filter 605 nm Long Pass | Equipment | SciMedia | ||
| THT Sideways | Equipment | SciMedia | 25 BM-8 | |
| Mini Ball Joint Holder | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0177 | |
| Small Stimulation Electrode Set | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0160 | |
| BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform | Equipment | Technology Inc., Inglewood, CA 90301 | 25 BM-6 | |
| Monopolar ECG Electrode | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0200 | |
| Roller Pump SCI 400 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 401U/D1 | |
| Roller Pump MasterFlex Easy Load II | Equipment | Cole-Parmer | Model 77201-60 | |
| Tubing Marprene #14 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 902.0016.016 | |
| MasterFlex Tubing | Equipment | PharMed, Westlake, OH 44145 USA | 06485-25 | |
| S48 Square Pulse Stimulator | Equipment | Grass Technologies | Model S48 | |
| SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT | Equipment | Grass Technologies | Model SIU5 | |
| 5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-5 | |
| 2 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-2 | |
| 0.5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-0 | |
| 0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-025 | |
| 10 ml Heating Coil | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 158822 | |
| Compliance Bubble Trap | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 130149 | |
| Luer Disconnect Cannula | Equipment | Harvard Apparatus | 72-1444 | |
| 3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 72-2630 | |
| Thermocouple Thermometer | Equipment | Cole-Parmer | WU-91100-40 | |
| Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe | Equipment | PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA | IT-24P | |
| Oscilloscope Tektronix TDS 1002 | Equipment | Tektronix, Inc. | TDS 1002B | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Reagent | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Ketamine HCl | Reagent | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Xylazine | Reagent | Lloyd, Inc. | LB15705A | |
| E-TOXA-CLEAN® | Reagent | Sigma-Aldrich | E9029 | |
| Di-8-ANEPPS | Reagent | Invitrogen | D-3167 |
References
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- Hucker, W. J. Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction. Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).
- Entcheva, E. Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system. IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).
- Stamm, C. Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha. Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).
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- Skrzypiec-Spring, M. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
