Summary
Den här artikeln beskriver en hög tidsmässiga och geografiska teknik för att optiskt bild aktionspotential rörelse på ytan av Langendorff-perfusion råtta hjärtan med hjälp av en potentiometrisk färgämne (di-8-ANEPPS).
Abstract
Optisk kartläggning av hjärtats yta med spänningskänsliga fluorescerande färger har blivit ett viktigt verktyg för att undersöka elektrisk excitation i experimentella modeller som varierar i skala från cellodlingar till hel-organ
Protocol
Del 1: Förbered lösningar och den isolerade perfusion hjärtat systemet
- På morgonen av experimentet är 4,0 L i Krebs-Henseleit lösningen enligt tidigare beskrivits [5, 6].
- 11 mmol / l 2,3-butanedione monoxime (BDM) löses i 1,0 L i Krebs-Henseleit lösningen dekanteras från perfusatet bereddes i steg 1,1.
- En ytterligare 150 ml Krebs-Henseleit tas bort från perfusatet bereddes i steg 1,1 och blandas med 5 mol / l di-8-ANEPPS (efter utspädning från en 10 mmol / L lager upplöst i dimetylsulfoxid (DMSO)).
- Dessa tre lösningar överförs till vattenmantlad glas reservoarer (Radnoti) där de är förvärmda till 41,0 ° C och syresatt med en nedsänkt bubbelflaskan (Radnoti) med 0,2 ìm-filtreras 95% O 2, 5% CO 2-gas. Lösningar från 3 lager reservoarer pumpas till den väggmonterade Langendorff system med MasterFlex ™ L / S peristaltiska pumpar och låg absorption silikonslang (Cole-Parmer).
- Före montering, är det Langendorff systemet glas (Radnoti) minutiöst tvättas med E-TOXA-CLEAN reagens (Sigma-Aldrich) och sköljas med 0,1 M / L HCl, 100% etanol och destillerat vatten.
- Den icke-recirkulerande Langendorff apparater byggdes för att leverera 70 mm Hg med konstant tryck från 3 separata syresatt reservoarer, som är separerade från hjärtat med vattenmantlad värmeslingor och fällor bubbla (Radnoti) [7]. Den 3 oberoende perfusion linjer konvergerar ovanför hjärtat på två 3-vägs kranar, tillåter oss att exakt kontrollera leverans av lösningar som upprättats i steg 1.1 till 1.3. Vattenmantlad glas är ansluten i serie med MasterFlex PharMed BPT slang (Cole-Parmer) och värmas till 39 ° C med destillerat vatten med två E100 cirkulationspumpar (Lauda). Värmeförlusterna genom platina-härdad silikonslang (Cole-Parmer) som ansluter tryck-huvudet reservoarer till värmeslingor och fällor bubblan resulterade i en 37 ° C perfusat når kärnan.
Del 2: Harvest råttan hjärtat och set-up Langendorff perfusion
- Att inducera bedövning i 200-250 g Lewis råttor är 100 mg / kg ketamin och 10 mg / kg Xylazine injiceras i intraperitoneal hålighet. Till denna blandning, lägger vi 500 E / kg Heparin förhindrar blodkoagulation och myokardischemi under borttagning förfarandet.
- För enkel tillgång till hjärtat och de stora blodkärlen, är den främre bröstväggen bort. Efter det är omgivande vävnad noggrant dissekeras och perikardiell säcken öppnas.
- Efter identifiering av sämre vena cava, är detta fartyg knyts ihop med 5-0 silke (Ethicon) och hela hjärt-lung-block är explanterade. Tissue är omedelbart placeras i iskallt Krebs-Henseleit lösning i en 50 ml bägare på is.
- Aorta ascendens snabbt identifieras och dissekerade från den omgivande vävnaden. En lämplig storlek kanyl (Harvard apparater) sätts in i aorta, ta hand att undvika ett avbrott obligatoriska genomblödning i hjärtats kranskärl genom att sätta in kanylen för långt in i aortaroten. Kanylen är fastsatt i aorta ascendens med 5-0 silke (Ethicon).
- Råttan hjärta placeras sedan på Langendorff apparaten utan att introducera luftbubblor i kanylen. Retrograd koronar vaskulär genomblödning är nu etablerad med varma syresatt, Krebs-Henseleit lösning från tryck-huvudet beskrivs i steg 1,6.
- Extra vävnad, inklusive lungor, är nu bort och hjärtat är perfusion i 20 minuter för att tillåta återhämtning av funktion och stabilisera rytmen. Under denna tid, är en mycket tunn termoelement temperaturgivare (Cole-Parmer) införs i vänster kammare hålrum och sys på plats med 5-0 Prolene sutur (Ethicon). Sonden är ansluten till en termo-controller (Digi-Sense) för att säkerställa temperaturen på hjärtat är vid 37 ° C genom att justera inställningarna för vattenpumpar cirkulationssystemet. Motion från perfusat droppar från hjärtats apex minimeras genom att placera en bit gasväv i utflödet kärlet.
Del 3: Ladda hjärta med potentiometrisk färg och förvärva electrographic och optiska signaler
- Di-8-ANEPPS (Invitrogen) laddas in i hjärtat genom att växla till perfusion raden med Krebs-Henseleit blandas med fluorescerande färg med hjälp av en kran. Dessutom är en 18G kanyl placeras i vänster och / eller höger förmak och ytterligare 50 ml färglösningen långsamt administreras i var och en av dessa avdelningar eftersom de inte är tillräckligt perfusion med färgämne som infördes genom kranskärlen.
- Under lastning förfarandet är tre EKG-avledningar (Harvard apparater) försiktigt placeras på ytan av hjärtat som inte är vänd mot optik som används för mappning. Elektrod Nr 1 är placerad på den bakre apikala delen av vänster kammare, N o 2 på vänster förmak, och N
- EKG-förstärkare (Hugo Sachs Elektronik) inställningar: Högpassfilter: 0,1 Hz
Lågpassfilter: 150 Hz - CMOS kamera (redshirt Imaging) och makroskop positioneras med hjälp av XYZ justeringar så att ytan av hjärtat står i fokus och centrerad i förvärvet ramen. Kameran och optik är monterade på en vibrationsisolering tabell (Minus K Technology) för att minimera resonansfrekvenser. Samtidigt, en koaxial pacing elektrod (Harvard apparater) kontrolleras med en isolerad, S48 el-stimulering enhet (gräs), är placerad på höger förmak och hjärtat är tempo på 300 slag per minut (Figur 1).
- Elektrisk stimulering (gräs) inställningar:
Betyg: 5 pulser per sekund
Fördröjning: 0,2 ms
Längd: 2 ms
Volt: 6-12 V
Mode: Upprepa
Puls: Singel - För optiska inspelningar som saknar artefakterna från kontraktion, måste hjärtat vara elektromekaniskt frikopplas. Vi gör detta genom att återigen byta perfusion linjer till Krebs-Henseleit lösning som innehåller 11 mmol / l BDM. Mellan förvärv, är hjärtat perfusion med oförfalskat Krebs-Henseleit hjälpa till att bevara livskraften i beredningen.
- Inspelningen parametrar ställs in med hjälp av programvaran (redshirt Imaging) med följande förvärvet inställningar:
Konfiguration: 2000 Hz, 128x128 pixel rad
Ram Intervall: 0,5 ms
Kamera Förstärkare Gain: 5x
On-Chip Gain: 8x-12Me brunnar
Slutare: 500 ms fördröjning
Antal Ramar: 4000
Varaktighet: 2000 ms - Alla rum och utrustning släcks eller skärmad för att eliminera bakgrundsljud under inspelning. LED-lampa som lyser upp hjärtat bara under den optiska inspelningen för att minska foto-blekning och färgning toxicitet. Ljuskällan Slutaren styrs med en 5 V puls levereras via kontrollpanelen genom en D-till-En styrelse i datorn (redshirt Imaging).
Del 4: Analysera förvärv information med hjälp av programvara redshirt Imaging
- Efter förvärvet är uppgifter som behandlats med olika filter inställningar. Vi använder i allmänhet standardinställningarna, utom vid justering av Band Stopp / Pass filtret, som är satt med vänster gränsen på 44,0 och det högra hörnet på 98,0. Efteråt den registrerade informationen behandlas och en film genereras (redshirt Imaging).
- Data från ett förvärv motsvarar den lokala elektriska aktiveringen på 16.384 platser på hjärtat ytan under en period av 2 sekunder. Programvaran tillåter dessa lokala signaler direkt jämföras med varandra och med förmak och kammare electrographic inspelningar. Data är sedan visualiseras genom kartläggning lokala elektriska aktivering till färg och gör denna information som en animation som visar Spatiotemporal elektriska aktiveringen på hjärtats yta. För att skapa en sådan animering använder vi programvara för att:
- tidsmässigt och / eller rumsligt filtrera data
- Välj en start-och sluttid för animeringen
- karta optiska signaler till färg baserat på vila ljusstyrkan för varje pixel
- överlagra den resulterande färgen data med en bild av hjärtat
- generera animering
Del 5: representativa resultat
Om perfusion hjärtat preparatet var orörlig under inspelningen, de optiska signalerna visar en tydlig topp för varje pixel inblandade i en förändring av utsläpp intensitet di-8-ANEPPS. Motsvarande filmer (figur 3 och 4) visar en front excitation våg sprida över epicardial ytan av hjärtat samt samtidigt förvärvat electrographic inspelningar (figur 2).
Figur 1. Ett fotografi av en Langendorff-perfusion hjärtat förberedelse skildrar positioner pacing elektrod på höger förmak och EKG-avledningar som beskrivs i steg 3,2.
Figur 2. Representant optiska signaler och electrographic inspelningar från en perfusion Lewis råtta hjärta. Panel A visar en bild av epicardial yta som används för optisk avbildning. Placeringen av bildpunkterna valt att visa på förändringar i fluorescens utsläpp över tiden Panel B markeras med färgade pilar. Electrographic signaler visas i panelen C med den röda linjen visar förmaksflimmer aktivering och den ljusblå linjen motsvarar ventrikulära signalen. Vänligenve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg "> klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Avlägsnandet av hjärta från bedövas råttor måste utföras snabbt för att undvika myokardischemi. Om ischemi eller otillräcklig koronar genomblödning inträffar kommer hjärtat att utveckla sannolikt arytmier och kan bli infarktområdet. Dessutom kommer dessa hjärtan visar otillräcklig fluorescens utsläpp för informativ inspelningar och efterföljande analyser. Innan du laddar färgen, hjärtmuskelceller behöver adekvat perfusion med Krebs-Henseleit lösning för att skapa och upprätthålla en fysiologisk elektrolyt miljö för stabiliteten i elektriska impulser. Noggrann förberedelse av perfusatet är också nödvändigt att upprätthålla korrekt orgel livskraft och funktion. Skillnader i elektrolyt koncentration eller otillräcklig filtrering av perfusatet kommer förmodligen att leda till dödlig hjärtinfarkt dysfunktion och hjärtsjukdomar rytm. För den optiska inspelningar, måste hjärtat vara helt laddad med spänningskänsliga färgämne. Detta är särskilt viktigt för förmaksflimmer hjärtmuskeln eftersom dessa kammare inte är väl perfusion av kranskärlen. Vi har funnit att ytterligare inom cavitary genomblödningen i förmak kommer att etablera en bra optisk signal. Dessutom kräver förvärv av högsta kvalitet spänning tracings den perfunderade hjärtat att vara stilla, annars kan förändringar i fluorescens utsläpp inte säkert användas för att spåra förändringar i membranpotential med high fidelity på grund av artefakter orsakade av signalen drift. Detta kommer att resultera i flera toppar för en pixel i stället för en enda topp. Andra metoder för att eliminera rörelse artefakter från optiska inspelningar inkluderar mekanisk immobilisering, behandling med andra excitation-kontraktion uncouplers (t.ex. cytochalasin D, blebbistatin), signalbehandling, och med matematisk modellering [1, 8]. Slutligen beskrivs den metod som här bara ger information om aktionspotential rörelser på hjärtats epicardial ytan. Alternativa vävnad förberedelser och infraröd potentiometrisk färgämnen kan lösa de elektriska spridningsegenskaper i andra delar av hjärtat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av Institutional Animal Care och användning kommittén vid barnsjukhuset Boston.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av forskningsanslag från National Institutes of Health (HL068915, HL088206) och bidrag till hjärtöverledning fonden vid barnsjukhuset Boston.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| CardioCMOS-SM128f | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| CardioPlex Software | Equipment | RedShirtImaging, LLC | ||
| LUXEON LED Light Source 460-490 nm | Equipment | Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA | LXHL-PB02 | |
| ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik | Equipment | Harvard Apparatus | 730149 | |
| Dichroic Mirror 505 nm | Equipment | Semrock | FF505-SDi01-25x36 | |
| Emission Filter 605 nm Long Pass | Equipment | SciMedia | ||
| THT Sideways | Equipment | SciMedia | 25 BM-8 | |
| Mini Ball Joint Holder | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0177 | |
| Small Stimulation Electrode Set | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0160 | |
| BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform | Equipment | Technology Inc., Inglewood, CA 90301 | 25 BM-6 | |
| Monopolar ECG Electrode | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 73-0200 | |
| Roller Pump SCI 400 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 401U/D1 | |
| Roller Pump MasterFlex Easy Load II | Equipment | Cole-Parmer | Model 77201-60 | |
| Tubing Marprene #14 | Equipment | Watson-Marlow Pumps Group | 902.0016.016 | |
| MasterFlex Tubing | Equipment | PharMed, Westlake, OH 44145 USA | 06485-25 | |
| S48 Square Pulse Stimulator | Equipment | Grass Technologies | Model S48 | |
| SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT | Equipment | Grass Technologies | Model SIU5 | |
| 5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-5 | |
| 2 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-2 | |
| 0.5 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-0 | |
| 0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 120142-025 | |
| 10 ml Heating Coil | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 158822 | |
| Compliance Bubble Trap | Equipment | Radnoti Glass Technology Inc. | 130149 | |
| Luer Disconnect Cannula | Equipment | Harvard Apparatus | 72-1444 | |
| 3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers | Equipment | Harvard Apparatus | BS4 72-2630 | |
| Thermocouple Thermometer | Equipment | Cole-Parmer | WU-91100-40 | |
| Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe | Equipment | PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA | IT-24P | |
| Oscilloscope Tektronix TDS 1002 | Equipment | Tektronix, Inc. | TDS 1002B | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Reagent | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Ketamine HCl | Reagent | Hospira Inc. | RL-0065 | |
| Xylazine | Reagent | Lloyd, Inc. | LB15705A | |
| E-TOXA-CLEAN® | Reagent | Sigma-Aldrich | E9029 | |
| Di-8-ANEPPS | Reagent | Invitrogen | D-3167 |
References
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).
- Hucker, W. J. Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction. Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).
- Entcheva, E. Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system. IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).
- Stamm, C. Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha. Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).
- Choi, Y. H. Cardiac conduction through engineered tissue. Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).
- Skrzypiec-Spring, M. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Fedorov, V. V. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).
