Dissezione di Saccharomyces cerevisiae Asci

Summary

Micromanipolazione di cellule di lievito è necessaria per l'analisi genetica meiotica o per selezionare zigoti diploidi. Queste micromanipolazioni vengono effettuate utilizzando il microago di un microscopio dissezione. Il microago viene utilizzato per trasferire le cellule ed è controllato da un micromanipolatore che sono disponibili con diversi gradi di automazione.

Abstract

Il lievito è un sistema modello altamente trattabile che viene utilizzato per studiare molti processi cellulari diversi. Il ceppo di laboratorio comune

Protocol

Costruzione di ceppi diploidi
Protocollo per la produzione di diploidi con l'accoppiamento

1. I ceppi iniziale deve essere colpito sulla media YPD, o selettivo, se necessario, per la produzione di singole colonie. I due ceppi aploidi dovrebbe essere di tipo accoppiamento opposto (cioè Mata e MATα).
2. Utilizzando un'ansa sterile inoculazione raccogliere una piccola porzione di una colonia da uno dei due ceppi aploidi. Su una striscia nuova piastra YPD il ciclo una volta in linea retta tutta la piastra. Segnare la direzione della striscia con una freccia sul fondo del piatto.
3. Ripetere l'operazione per il secondo ceppo sulla stessa piastra YPD. Questa volta la vena colonia perpendicolare alla prima, attraversando la striscia prima con la seconda. Segnare la direzione della striscia secondo e nota l'area in cui la vena seconda attraversa il primo. Questa zona sarà dove diploidi saranno prodotti.
4. Incubare la piastra YPD a 30 ° C durante la notte.
5. Replica piastra la piastra YPD su terreni selettivi che permettono selettivamente la crescita della neo-costituita diploidi.
6. Scegli una singola colonia, se possibile, o una piccola porzione della stria diploide e strisciare sullo stesso mezzo selettivo per generare singole colonie.

Sporulazione e la digestione di aschi
Protocollo

1. Scegli singole colonie dalla piastra sopra e fai piccoli (1 cm x 1 cm) patch su sporulazione (SPO) piastre e incubare a 30 ° C per 3-7 giorni a sporulare.
2. Sporulazione può essere controllato, cercando in cellule di ogni patch sotto un microscopio ottico. Cellule posto su un vetrino da microscopio in 5-10 microlitri di acqua, mettere un coprioggetto sulla parte superiore della goccia, e cercare la presenza di aschi. Se aschi non si trovano facilmente poi rimesso nell'incubatrice.
3. Se c'è sporulazione efficace in una delle patch, preparare una sterile tubo 15 ml coniche con 100μL di succo di tetrade.
4. Cellule di Pick up da questa patch sporulazione con un'ansa sterile inoculazione 3 mm (le cellule dovrebbero coprire ¼ del ciclo) e posto nel succo tetrade. Capovolgere delicatamente il ciclo per permettere alle cellule di cadere il ciclo e mescolare con la soluzione.
5. Lasciare in succo tetrade (contenente zymolyase) per 4-10 minuti (a seconda della concentrazione e l'attività di zymolyase e dello stesso ceppo). Questo permette la digestione della parete cellulare che circonda il ascospore.
6. Segna parte superiore e inferiore della regione inoculo su un piatto YPD.
7. Opzionale. Reazione può essere interrotta con l'aggiunta di 1 ml di freddo ghiaccio sterile dH ₂ O. Permettono alle cellule di accontentarsi di 5 minuti. Rimuovere il surnatante da 1 ml quindi mescolare delicatamente a mano e tenere sul ghiaccio.
8. Prendere 5μL di cellule digerito dal passaggio 5 e delicatamente posto gocce in una linea nella regione di inoculo del pre-segnato piastra YPD.
9. Utilizzare un'ansa sterile inoculazione 3mm a molto delicatamente diffondere i tempi di 1-3 gocce in una linea, mentre appena il contatto con l'agar.
10. Lasciare che il liquido di assorbire in agar (se viene omesso il passaggio 7, questo è quando la digestione della parete cellulare esterna sarà ridotta o fermata). Procedere al microscopio dissezione.

Dissezione di Asci
Protocollo

Si noti che il protocollo qui descritto si un microscopio Singer sistema di micromanipolazione MSM 200. Questo protocollo può essere seguito con lievi modifiche se si utilizza un micromanipolatore manuale come un micromanipolatore Zeiss MR.

1. Focus su una regione della piastra dove la metà del campo contiene cellule e mezzo è vuoto. Portare lentamente l'ago a fuoco in modo che tocca la regione vuota del campo. Questo farà sì che l'ago non contiene cellule di un uso precedente. Il contatto tra l'ago e l'agar è visto come un cerchio nero scuro che viene lentamente a fuoco.
2. Vai alla matrice in A1 posizione e fare un segno penetrante l'agar di nuovo. Questo è per aiutare a determinare l'orientamento della piastra se viene tolto il microscopio prima del completamento.
3. Passare alla modalità di ricerca. Individuare un aschi. Scegliere preferibilmente aschi che si trovano in aree in cui le cellule sono ben distribuiti. Evitare le zone con i cluster di cellule. I quattro ascospore da un aschi dovrebbe essere ancora attaccati l'uno all'altro. Due ascospore possono essere leggermente più grande rispetto agli altri due. Evitare di raccogliere aschi ascospore dove si è sciolto e non collegata al resto del ascospore.
4. Prendere un asco con l'ago. Portare lentamente l'ago fino alla piastra. Quando l'ombra del microago è visto, questa linea con l'asco di essere raccolti. Nuovo approccio l'ago fino a quando la sagoma nera di un cerchio (la punta dell'ago) si vede. Toccare il tetrade con questo cerchio e poi rapidamente tirare l'ago via. Assicurarsi che i quattro ascospore da un asco hanno aderito l'ago e che non le cellule supplementari sono stati raccolti sulla microago che non fanno parte di questo ASCUS.
5. Tirare il microago lontano dal piatto e andare alla matrice (per la asco prima, andare aposizione A1). Prendere nota di ogni posizione in cui viene spostato uno asco. Posizionare il asco giù toccando il piatto con il microago e tirando via fino a tutte e quattro le ascospore si stacca il microago. Picchiettando leggermente il braccio ago o la piattaforma che fissano la piastra YPD è spesso utile in questa fase.
6. Ripetere i passaggi 3-5 e posto aschi giù in posizioni consecutive sulla matrice fino a quando il numero desiderato di aschi sono stati raccolti.
7. Torna alla ciascun asco e rompere le quattro celle a parte da prendere in giro con l'ago, picchiettando delicatamente la piattaforma o una combinazione di entrambi. Raccogliere le cellule lasciando uno dietro a una nuova posizione nella matrice fino a che ogni ascospore in ogni asco è divisa in file di quattro.
8. Posizionare la piastra YPD in un incubatore a 30 ° C per diversi giorni per osservare il modello di crescita.
9. Replica piastra le cellule sezionato per terreno selettivo se necessario.

Trasferimento di zigoti
Protocollo

1. Streak fuori due ceppi aploidi con i tipi di accoppiamento opposto sul terreno adeguato per ottenere colonie singole.
2. Compagno di questi due ceppi, come descritto sopra e lasciar crescere da 4 a 6 ore (o tutta la notte se necessario).
3. Verificare la presenza di zigoti sotto un microscopio ottico. Zigoti apparirà come manubrio a forma di cellule con o senza una gemma.
4. Raccogliere le cellule con un ciclo inoculazione 3 mm (le cellule dovrebbero coprire ¼ del ciclo) e posto delicatamente in 100μL di sterili dH ₂ O.
5. Segna parte superiore e inferiore della regione inoculo su un piatto YPD.
6. Prendere 5μL e delicatamente posto gocce in una linea nella regione di inoculo del pre-segnato piastra YPD.
7. Usare un ciclo 3 millimetri inoculazione di diffondere le gocce in una linea molto delicatamente, mentre appena il contatto con l'agar.
8. Lasciare che il liquido di assorbire in agar. Procedere al microscopio dissezione.
9. Focus su una regione della piastra dove la metà del campo contiene cellule e mezzo è vuoto. Portare lentamente l'ago a fuoco in modo che tocca la regione vuota del campo. Questo farà sì che l'ago non contiene cellule di un uso precedente. Il contatto tra l'ago e l'agar è visto come un cerchio nero scuro che viene lentamente a fuoco.
10. Vai alla matrice in A1 posizione e fare un segno penetrante l'agar di nuovo. Questo è per aiutare a determinare l'orientamento della piastra se viene tolto il microscopio prima del completamento.
11. Passare alla modalità di ricerca. Individuare uno zigote.
12. Prendete uno zigote con l'ago.
13. Luogo zigoti individualmente sulla matrice.
14. Lasciare zigoti a crescere per alcuni giorni.
15. Piastra replica il zigoti sul mezzo adeguato selettivo.

Rappresentante Risultati

Figura 1: L'accoppiamento di due ceppi aploidi di tipi di accoppiamento opposto genera un ceppo diploide.

Figura 2: (A) Un piatto YPD con risultati thre di un incrocio tra un ceppo sensibile alla temperatura (con un auxotrophy leu2) e un ceppo wild-type (LEU2). Cellule digeriti sono sparsi nella regione di inoculo sulla sinistra dove si vede la crescita di spessore tra le due linee nere. Aschi che sono stati sezionati crescere equidistanti nella matrice di destra. (B) La piastra in (A) è stato replicato su una SD-Leucina drop-out piatto. Si noti la 02:02 di crescita per il marcatore LEU2 indica un ascospore convalidato è stato dissezionato. (C) La piastra in (A) è stato replicato su un piatto YPD e incubate a 37 ° C. Si noti il ​​02:02 crescita che conferma ulteriormente che un ascospore è stato dissezionato.

Discussion

Dissezione lievito è un utile strumento per selezionare nuove varietà con marcatori desiderato. Nel determinare il modello teorico di crescita di quattro ascospore è importante guardare al genotipo della cellula vegetativa. Se un plasmide è presente, si deve sapere se è solo esemplare, alto o basso, come questo influirà che ascospore (s) ricevono il plasmide e influenzerà le previsioni e conclusioni per quanto riguarda i ceppi manipolati.

Alcuni ceppi possono sporulare meglio di altri la produzione di ascospore molti in un breve periodo di tempo. Altri ceppi possono produrre solo una bassa percentuale di ascospore. Questo non ha alcun effetto sul esperimento finché abbastanza aschi vero può essere selezionato. Inoltre, ceppi di rispondere in modo diverso durante la digestione della parete cellulare ed è necessario regolare empiricamente il tempo di incubazione nel succo tetrade.

Quando si selezionano le celle con i marcatori desiderata, si dovrebbe solo scegliere quelli che provengono da una aschi dove il modello di crescita di tutte le ascospore corrispondono al modello di crescita teorica e da una dissezione dove la stragrande maggioranza di tutte le ascospore portare al modello di crescita attesi.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Singer MSM System 200	Microscope	Singer Instruments	NA
D-sorbitol	Reagent	BioShop Canada	SOR508
Tris	Reagent	BioShop Canada	TRS001
Zymolyase 100T	Reagent	Seikagaku Corporation	120493
Yeast extract	Reagent	BioShop Canada	YEX401
Peptone	Reagent	BioShop Canada	PEP 403
D-glucose	Reagent	BioShop Canada	GLU501
Yeast nitrogen base	Reagent	BioShop Canada	YNB406
Bio-tryptone	Reagent	BioShop Canada	TRP402
Sodium chloride	Reagent	BioShop Canada	SOD002
Potassium acetate	Reagent	BioShop Canada	POA 301
Agar	Reagent	BioShop Canada	AGR003
Adenine sulfate	Reagent	BioShop Canada	ADS201
L-uracil	Reagent	BioShop Canada	URA 241
L-tryptophan	Reagent	BioShop Canada	TRP 100
L-histidine	Reagent	BioShop Canada	HIS 200
L-arginine	Reagent	Amresco	0877-100G
L-methionine	Reagent	BioShop Canada	MET 222
L-tyrosine	Reagent	BioShop Canada	TYR 333
L-isoleucine	Reagent	BioShop Canada	ISO 910
L-valine	Reagent	BioShop Canada	VAL 201
L-lysine	Reagent	BioShop Canada	LYS 101
L-phenylalanine	Reagent	BioShop Canada	PHA 302
L-glutamic acid	Reagent	BioShop Canada	GLU 202
L-threonine	Reagent	BioShop Canada	THR002
L-leucine	Reagent	BioShop Canada	LEU 222