Summary
Mikromanipulation von Hefezellen ist für meiotischen genetische Analyse oder diploiden Zygoten wählen erforderlich. Diese Mikromanipulationen werden mit dem Mikronadel einer Dissektionsmikroskop durchgeführt. Die Mikronadel wird verwendet, um Zellen zu verlagern und wird durch einen Mikromanipulator, die mit verschiedenen Graden der Automatisierung gesteuert werden.
Abstract
Hefe ist ein sehr praktische Zwecke geeigneten Modells, das verwendet werden, um viele verschiedene zelluläre Prozesse zu studieren. Das gemeinsame Labor-Stamm
Protocol
Bau der diploiden Stämme
Protokoll für die Herstellung von Diploiden durch Paarung
- Die ersten Stämme sollte auf YPD oder selektiven Medium getroffen werden, wenn nötig, einzelne Kolonien zu produzieren. Die beiden haploiden Stämmen sollte der entgegengesetzten Paarungstyps (dh Mata und MATα) werden.
- Mit einer sterilen Impföse holen einen kleinen Teil einer Kolonie von einer der beiden haploiden Stämmen. Auf einer neuen YPD Platte Streifen die Schleife einmal in einer geraden Linie über die Platte. Markieren Sie die Richtung der Streifen mit einem Pfeil an der Unterseite der Platte.
- Wiederholen Sie dies für den zweiten Stamm auf dem gleichen YPD Platte. Diesmal Streifen der Kolonie senkrecht zu den ersten, überqueren den ersten Streifen mit dem zweiten. Markieren Sie die Richtung des zweiten Streifen und notieren Sie den Bereich, wo der zweite Streifen kreuzt die erste. Dieser Bereich ist, wo Diploiden produziert werden.
- Inkubieren Sie die YPD Platte bei 30 ° C über Nacht.
- Replica Platte der YPD Platte auf selektiven Medien, die selektiv erlauben wird sich das Wachstum der neu gebildeten Diploiden.
- Wählen Sie eine einzelne Kolonie, falls möglich, einen kleinen Teil der diploiden Streifen und Streifen auf dem gleichen selektiven Medium, um einzelne Kolonien zu erzeugen.
Sporulation und Verdauung von Asci
Protokoll
- Wählen Sie einzelne Kolonien von der Platte oben und kleine (1cm x 1cm) Flecken auf Sporulation (SPO) Platten und Inkubation bei 30 ° C für 3-7 Tage zur Sporulation.
- Sporulation kann anhand der Zellen, die aus jedem Patch unter einem Lichtmikroskop überprüft werden. Legen Sie die Zellen auf einem Objektträger in 5-10 l Wasser, legen Sie ein Deckglas auf den Tropfen, und schauen auf das Vorhandensein von Asci. Wenn Asci nicht leicht zu finden sind dann legte zurück in den Inkubator.
- Wenn es einen wirksamen Sporulation in einer der Patches, bereiten ein steriles 15 ml konische Röhrchen mit 100 &mgr; l der Tetrade Saft.
- Pick-Zellen aus diesem Sporulation Patch mit einer sterilen Impföse 3mm (Zellen sollten ¼ der Schleife Abdeckung) und in der Tetrade Saft. Vorsichtig schwenken die Schleife, damit die Zellen zu fallen die Schleife und vermischen sich mit der Lösung.
- Lassen Sie in Tetrade Saft (mit Zymolyase) für 4-10 Minuten (abhängig von der Konzentration und Aktivität von Zymolyase und der Stamm selbst). Dies ermöglicht für die Verdauung der Zellwand umgibt die Ascosporen.
- Markieren Sie die Ober-und Unterseite des Inokulums Region auf einer YPD Platte.
- Optional. Reaktion kann durch Zugabe von 1 ml eiskaltem sterilen dH 2 O gestoppt werden Lassen Sie die Zellen für 5 Minuten zu begleichen. Entfernen 1ml aus dem Überstand anschließend leicht mischen mit der Hand und halten Sie auf dem Eis.
- Nehmen 5μL der verdauten Zellen aus Schritt 5 und sanft Ort fällt in eine Linie in das Inokulum Region des vorgezeichneten YPD Platte.
- Verwenden Sie eine sterile 3mm Impföse sehr vorsichtig die Tropfen 1-3 mal in einer Linie verteilt, während kaum Kontakt mit dem Agar.
- Lassen Sie die Flüssigkeit in den Agar aufnehmen (Wenn Schritt 7 angegeben ist, wird dies, wenn die Verdauung der äußeren Zellwand reduziert werden oder zu stoppen). Fahren Sie mit dem Dissektionsmikroskop.
Dissection der Asci
Protokoll
Beachten Sie, dass die folgenden Protokoll für einen Singer MSM System 200 Mikromanipulation Mikroskop beschrieben. Dieses Protokoll kann mit geringfügigen Änderungen, wenn mit einer manuellen Mikromanipulator wie Zeiss Mikromanipulator MR gefolgt werden.
- Konzentrieren Sie sich auf einen Bereich der Platte, wo die Hälfte des Feldes enthält Zellen und die Hälfte ist leer. Langsam bringen die Nadel in den Fokus, so dass es den leeren Bereich des Feldes berührt. Dadurch wird sichergestellt, dass die Nadel nicht enthalten Zellen, die aus einer früheren Nutzung. Der Kontakt zwischen der Nadel und der Agar wird als dunkler schwarzer Kreis, der sich langsam rückt in den Fokus zu sehen.
- Gehen Sie auf die Matrix an der Position A1 und markieren durch Durchstechen der Agar wieder. Dies ist zu helfen, die Orientierung der Platte, wenn es ausgeschaltet ist dem Mikroskop vor dem Abschluss übernommen.
- Wechseln Sie in den Suchmodus. Suchen Sie einen Asci. Vorzugsweise wählen Asci, die in Bereichen, in denen die Zellen gut verteilt werden sind. Vermeiden Sie Bereiche mit Zellhaufen. Die vier Ascosporen aus einer Asci sollte noch miteinander verbunden werden. Zwei Ascosporen kann etwas größer sein als die anderen beiden. Vermeiden Sie Kommissionierung Asci, wo man Ascosporen ist locker und nicht auf den Rest der Ascosporen verbunden.
- Pick up Ascus mit der Nadel. Langsam bringen die Nadel bis auf den Teller. Wenn der Schatten des Mikronadel gesehen wird, säumen diese mit dem Ascus, gepflückt zu werden. Wieder Ansatz der Nadel bis zum schwarzen Umriss eines Kreises (die Spitze der Nadel) zu sehen ist. Berühren Sie die Tetrade mit diesem Kreis und dann schnell ziehen Sie die Nadel entfernt. Achten Sie darauf, alle vier Ascosporen aus einem Ascus haben, um die Nadel eingehalten und dass keine weiteren Zellen wurden auf der Mikronadel, die nicht Teil dieser Ascus versammelt.
- Ziehen Sie die Mikronadel weit weg von der Platte und gehen Sie zu der Matrix (für die ersten Ascus, gehen Sie zuPosition A1). Beachten Sie jede Position, wo ein Ascus ist umgezogen. Legen Sie die Ascus sich durch Berühren der Platte mit der Mikronadel und wegziehen, bis alle vier Ascosporen kommen aus dem Mikronadel. Leichtes Ausschlagen der Nadel Arm oder die Plattform Halten der YPD Platte ist oft bei diesem Schritt hilfreich.
- Wiederholen Sie die Schritte 3-5 und Platz Asci sich an aufeinander folgenden Positionen in der Matrix, bis die gewünschte Anzahl von Asci haben abgeholt worden.
- Gehen Sie zurück zu jedem Ascus und brechen die vier Zellen abgesehen von Hänseleien mit der Nadel, tippen die Plattform sanft oder eine Kombination aus beidem. Pick-up die Zellen verlassen hintereinander in eine neue Position in der Matrix, bis jeder Ascosporen in jedem Ascus in Viererreihen getrennt ist.
- Legen Sie die YPD Platte in einem Brutschrank bei 30 ° C für mehrere Tage, um das Wachstum Muster zu beobachten.
- Replica Platte der sezierten Zellen selektiven Medium, wenn nötig.
Umzug von Zygoten
Protokoll
- Streak aus zwei haploiden Stämme mit entgegengesetzten Paarungstypen auf das entsprechende Medium, einzelne Kolonien zu erhalten.
- Mate diesen beiden Stämmen wie oben beschrieben und lassen von 4 bis 6 Stunden (oder über Nacht, wenn notwendig) zu wachsen.
- Prüfen Sie, ob Zygoten unter einem Lichtmikroskop. Zygoten als hantelförmige Zellen entweder mit oder ohne eine Knospe erscheinen.
- Pick-Zellen mit einem 3mm Impföse (Zellen sollten ¼ der Schleife Abdeckung) und platzieren Sie sanft in 100 &mgr; l sterilem dH 2 O.
- Markieren Sie die Ober-und Unterseite des Inokulums Region auf einer YPD Platte.
- Nehmen 5μL und sanft Ort fällt in eine Linie in das Inokulum Region des vorgezeichneten YPD Platte.
- Verwenden Sie einen 3mm Impföse die Tropfen in einer Linie sehr sanft verteilen, während kaum Kontakt mit dem Agar.
- Lassen Sie die Flüssigkeit in den Agar zu absorbieren. Fahren Sie mit dem Dissektionsmikroskop.
- Konzentrieren Sie sich auf einen Bereich der Platte, wo die Hälfte des Feldes enthält Zellen und die Hälfte ist leer. Langsam bringen die Nadel in den Fokus, so dass es den leeren Bereich des Feldes berührt. Dadurch wird sichergestellt, dass die Nadel nicht enthalten Zellen, die aus einer früheren Nutzung. Der Kontakt zwischen der Nadel und der Agar wird als dunkler schwarzer Kreis, der sich langsam rückt in den Fokus zu sehen.
- Gehen Sie auf die Matrix an der Position A1 und markieren durch Durchstechen der Agar wieder. Dies ist zu helfen, die Orientierung der Platte, wenn es ausgeschaltet ist dem Mikroskop vor dem Abschluss übernommen.
- Wechseln Sie in den Suchmodus. Suchen Sie eine Zygote.
- Pick-up eine Zygote mit der Nadel.
- Legen Sie Zygoten individuell auf die Matrix.
- Lassen Zygoten für mehrere Tage wachsen.
- Replica Platte die Zygoten auf die entsprechenden selektiven Medium.
Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1: Die Paarung von zwei haploiden Stämme gegenüber Paarungstypen erzeugt eine diploide Stamm.
Abbildung 2: (A) A YPD-Platte mit thre Ergebnisse einer Paarung zwischen einer Temperatur sensiblen Stamm (mit einem leu2 Auxotrophie) und einem Wildtyp-Stamm (LEU2). Aufgeschlossenen Zellen sind in der Inokulum Region auf der linken Seite, wo dicke Wachstum zwischen den beiden schwarzen Linien gesehen zu verbreiten. Asci, die seziert haben zu wachsen gleichmäßig in der Matrix auf der rechten Seite angeordnet. (B) Die Platte in (A) wurde auf eine SD-Leucin Drop-out-Platte repliziert. Beachten Sie das 2:2 Wachstum für die LEU2 Marker zeigt ein validiertes Ascosporen seziert wurde. (C) Die Platte in (A) wurde auf eine YPD Platte repliziert und bei 37 ° C. Beachten Sie das 2:2 Wachstum, das eine weitere Bestätigung, dass ein Ascosporen seziert wurde.
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Discussion
Hefe Dissektion ist ein nützliches Werkzeug, um neue Sorten mit den gewünschten Marker auszuwählen. Bei der Ermittlung des theoretischen Wachstumsmuster von vier Ascosporen ist es wichtig, bei der Genotyp des vegetativen Zelle aussehen. Wenn ein Plasmid vorhanden ist, muss man wissen, wenn es einzelne, niedrige oder hohe Kopie ist, da dies Auswirkungen auf die Ascosporen (s) das Plasmid erhalten und wird Prognosen und Schlussfolgerungen in Bezug auf die Stämme manipuliert zu beeinflussen.
Bestimmte Stämme können sporulieren besser als andere produzieren viele Ascosporen in einem kurzen Zeitraum. Andere Stämme können nur ergeben einen geringen Prozentsatz der Ascosporen. Dies hat keine Auswirkung auf das Experiment so lange genug wahr Asci ausgewählt werden können. Darüber hinaus Stämme reagieren unterschiedlich während Zellwand Verdauung und es ist notwendig, um empirisch Einstellung der Inkubationszeit in der Tetrade Saft.
Bei der Auswahl der Zellen mit der gewünschten Marker, sollte man nur wählen diejenigen, die von einem Asci, wo das Wachstum Muster aller Ascosporen, die theoretischen Wachstumsmuster entsprechen und von einer Dissektion, wo die überwiegende Mehrheit aller Ascosporen um das erwartete Wachstum Muster führen zu kommen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Arbeiten in Laboratorium des Autors wird von der Canadian Institutes of Health Research, der Canada Foundation for Innovation, der Natural Sciences and Engineering Research Council und der Concordia University gefördert.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Singer MSM System 200 | Microscope | Singer Instruments | NA | |
| D-sorbitol | Reagent | BioShop Canada | SOR508 | |
| Tris | Reagent | BioShop Canada | TRS001 | |
| Zymolyase 100T | Reagent | Seikagaku Corporation | 120493 | |
| Yeast extract | Reagent | BioShop Canada | YEX401 | |
| Peptone | Reagent | BioShop Canada | PEP 403 | |
| D-glucose | Reagent | BioShop Canada | GLU501 | |
| Yeast nitrogen base | Reagent | BioShop Canada | YNB406 | |
| Bio-tryptone | Reagent | BioShop Canada | TRP402 | |
| Sodium chloride | Reagent | BioShop Canada | SOD002 | |
| Potassium acetate | Reagent | BioShop Canada | POA 301 | |
| Agar | Reagent | BioShop Canada | AGR003 | |
| Adenine sulfate | Reagent | BioShop Canada | ADS201 | |
| L-uracil | Reagent | BioShop Canada | URA 241 | |
| L-tryptophan | Reagent | BioShop Canada | TRP 100 | |
| L-histidine | Reagent | BioShop Canada | HIS 200 | |
| L-arginine | Reagent | Amresco | 0877-100G | |
| L-methionine | Reagent | BioShop Canada | MET 222 | |
| L-tyrosine | Reagent | BioShop Canada | TYR 333 | |
| L-isoleucine | Reagent | BioShop Canada | ISO 910 | |
| L-valine | Reagent | BioShop Canada | VAL 201 | |
| L-lysine | Reagent | BioShop Canada | LYS 101 | |
| L-phenylalanine | Reagent | BioShop Canada | PHA 302 | |
| L-glutamic acid | Reagent | BioShop Canada | GLU 202 | |
| L-threonine | Reagent | BioShop Canada | THR002 | |
| L-leucine | Reagent | BioShop Canada | LEU 222 |
References
- Sherman, F., Hicks, J. Micromanipulation and Dissection of Asci. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Guthrie, C., Fink, G. R. , Academic Press. San Diego. 21-37 (1991).
