Препарирование Saccharomyces CEREVISIAE Сумки

Summary

Микроманипуляция дрожжевых клеток необходимо для мейоза генетического анализа или для выбора диплоидные зиготы. Эти micromanipulations осуществляются с помощью микроиглы о вскрытии микроскопом. Микроиглы используется для перемещения клетки и находится под контролем микроманипулятора, которые доступны с различной степенью автоматизации.

Abstract

Дрожжи очень послушный модель системы, которая используется для изучения различных клеточных процессов. Общая нагрузка лаборатории

Protocol

Строительство диплоидных штаммов
Протокол для производства диплоиды в результате скрещивания

1. Начальная штаммы должны быть исключены на YPD или селективной среде, в случае необходимости, для получения отдельных колоний. Два гаплоидных штаммов должны быть противоположного типа спаривания (т.е. Мата и MATα).
2. Использование стерильной петлей прививки выбрать небольшую часть колонии с одного из двух гаплоидных штаммов. На новом YPD полоса пластины цикла раз в прямой линией, пересекающей пластине. Марк направление штрих, с стрелку на нижней пластине.
3. Повторите эту процедуру для второго нагрузку на YPD же пластины. На этот раз полоса колонии перпендикулярно к первой, пересекая первую полосу со второй. Марк направление второй полосе и обратите внимание на область, где вторая полоса пересекает первую очередь. Эта область будет где диплоиды будет производиться.
4. Инкубируйте YPD пластины при температуре 30 ° С в течение ночи.
5. Реплика пластины YPD пластины на селективных средах, что будет выборочно разрешать рост новообразованных диплоиды.
6. Выберите одну колонию, если это возможно, или небольшая часть полосы диплоидных и полосы на тот же селективной среды для получения отдельных колоний.

Плодоношение и пищеварение асков
Протокол

1. Выберите одну из колоний пластины выше и делать небольшие (1см х 1см) пятна на споруляции (SPO) пластин и инкубировать при 30 ° С в течение 3-7 дней, чтобы sporulate.
2. Плодоношение можно проверить, посмотрев на клетки от каждого патча под световым микроскопом. Место клетки на предметном стекле микроскопа в 5-10 мкл воды, место покровное в верхней части капли, и посмотреть на наличие сумки. Если сумки не легко найти то положил обратно в инкубатор.
3. Если есть эффективные споруляции в одном из патчей, готовят стерильные 15 мл коническую трубку с 100 мкл сок тетрады.
4. Выберите клетки по сравнению с этим споруляции патч с стерильные 3 мм петля прививки (клетки должны охватывать четверть цикла) и место в соке тетрады. Аккуратно водоворот цикл, чтобы клетки падать петля и смешать с раствором.
5. Оставить в тетрады сок (содержащий zymolyase) для 4-10 минут (в зависимости от концентрации и активности zymolyase и деформаций себя). Это позволяет для переваривания клеточной стенки окружающего аскоспор.
6. Марк верхней и нижней части посевного области на YPD пластины.
7. Необязательно. Реакция может быть остановлено путем добавления 1 мл ледяной стерильной дН ₂ O. Разрешить клетки согласиться на 5 мин. Удалить из 1 мл надосадочной затем смешайте слегка рукой и держать на льду.
8. Возьмите 5 мкл переваренной клетки с шага 5, нежно кладем капель в строке в посевной области заранее заполненных YPD пластины.
9. Используйте стерильные 3 мм петля прививка очень мягко распространению капель 1-3 раза в линии, а едва контакт с агара.
10. Дайте жидкости впитаться в агар (шаг 7 Если не указано, это когда переваривание внешней клеточной стенки будут сокращены или остановка). Приступить к рассечение микроскопом.

Препарирование Аски
Протокол

Обратите внимание, что следующий протокол описан для системы Певица MSM 200 микроманипуляция микроскопом. Этот протокол может следовать с небольшими изменениями, если используется ручной микроманипулятора, таких как микроманипулятора Zeiss MR.

1. Сосредоточьтесь на области пластины, где половина поле содержит клетки и половину пуст. Медленно иглы в центр внимания, что она касается пустой области поля. Это гарантирует, что игла не содержат клетки от предыдущего использования. Контакт между иглой и агар рассматривается как темный черный круг, который медленно вступает в фокусе.
2. К матрице на позиции А1 и сделать отметку, прокалывая агар снова. Это поможет определить ориентацию пластины, если она снимается микроскопом до завершения.
3. Переключение в режим поиска. Найдите сумки. Предпочтительно выбирать сумки, которые находятся в районах, где клетки хорошо распространено. Избегайте мест с клеточными кластерами. Четыре аскоспор из сумки все равно должны быть привязаны друг к другу. Два аскоспор может быть немного больше, чем два других. Избегайте выбора сумки, где один аскоспор является свободным и не связан с остальными аскоспор.
4. Возьмите сумке с иглой. Медленно иглы до пластины. Когда тени микроиглы видно, линии это с сумке, чтобы ее взяли. Снова подход иглы, пока черный контур круга (кончик иглы) не наблюдается. Сенсорный тетрады с этим кругом, а затем быстро вытащить иглу прочь. Убедитесь, что все четыре аскоспор от аск присоединившимся к игле и что никакие дополнительные ячейки были собраны на микроиглы, которые не являются частью этой сумке.
5. Вытяните микроиглы далеко от плиты и перейти к матрице (для первого сумке, перейдите кпозиция А1). Обратите внимание на каждую позицию, где аск перемещается. Место аск вниз, касаясь пластины с микроиглы и трогания с места, пока все четыре аскоспор оторваться микроиглы. Нежный прослушивание руки иглу или платформы холдинга YPD пластины часто бывает полезно на этом шаге.
6. Повторите шаги 3-5 и место сумки вниз на последовательных позиций на матрице до желаемого количества сумки были собраны.
7. Вернитесь к каждой сумке и сломать четыре клетки на части дразня с иглой, постукивая платформы мягко или комбинация обоих. Возьмите клетки, оставляя одну позади на новую позицию в матрице, пока каждый аскоспор В каждой сумке разделен на строки из четырех человек.
8. Место YPD пластины в инкубаторе при температуре 30 ° С в течение нескольких дней наблюдать модель роста.
9. Реплика пластины расчлененные клеткам селективные среды, если это необходимо.

Перемещение Зиготы
Протокол

1. Подряд два гаплоидных штаммов с противоположных типов спаривания на соответствующую среду для получения отдельных колоний.
2. Мать этих двух штаммов, как описано выше, и позволяют выращивать в возрасте от 4 до 6 часов (или на ночь, если это необходимо).
3. Проверьте зиготы под световым микроскопом. Зиготы появится как гантели клетки с помощью или без почки.
4. Выберите клетки с 3 мм петля прививки (клетки должны охватывать четверть цикла) и место мягко 100 мкл стерильной дН ₂ O.
5. Марк верхней и нижней части посевного области на YPD пластины.
6. Возьмите 5 мкл, нежно кладем капель в строке в посевной области заранее заполненных YPD пластины.
7. Используйте 3 мм петля прививки распространяться капель в линию очень мягко в то время как едва контакт с агара.
8. Дайте жидкости впитаться в агар. Приступить к рассечение микроскопом.
9. Сосредоточьтесь на области пластины, где половина поле содержит клетки и половину пуст. Медленно иглы в центр внимания, что она касается пустой области поля. Это гарантирует, что игла не содержат клетки от предыдущего использования. Контакт между иглой и агар рассматривается как темный черный круг, который медленно вступает в фокусе.
10. К матрице на позиции А1 и сделать отметку, прокалывая агар снова. Это поможет определить ориентацию пластины, если она снимается микроскопом до завершения.
11. Переключение в режим поиска. Найдите зиготы.
12. Возьмите зиготы с иглой.
13. Место зиготы индивидуально на матрицу.
14. Разрешить зиготы расти в течение нескольких дней.
15. Реплика пластины зиготы на соответствующей селективной среде.

Представитель Результаты

Рисунок 1: спаривание двух гаплоидных штаммов противоположных типов спаривания генерирует диплоидного штамма.

Рисунок 2: () YPD пластины с Автошоу результаты спаривания между температурой чувствительного штамма (с leu2 auxotrophy) и дикого типа (LEU2). Дайджестом клетки распространяются в регионе посевной слева, где толстые роста между двумя черными линиями видел. Сумки, которые были расчлененные расти равномерно распределенных в матрице справа. (B) пластина в (А) была воспроизведена на SD-лейцин, бросающих пластины. Обратите внимание, 2:02 роста LEU2 маркер, указывающий проверки аскоспор был расчленены. (C) пластина в (А) была воспроизведена на YPD пластины и инкубировали при 37 ° C. Обратите внимание, 2:02, что дальнейший рост подтверждает, что аскоспор были расчленены.

Discussion

Дрожжи вскрытия является полезным инструментом для выбора новых штаммов с нужными маркерами. При определении теоретической модели роста из четырех аскоспор важно, чтобы смотреть на генотип вегетативные клетки. Если плазмиды присутствует, надо знать, если она не замужем, низкая или высокая копию как это повлияет на котором аскоспор (ы) получают плазмиды и повлияет на прогнозы и выводы в отношении штаммов манипулируют.

Некоторые штаммы могут sporulate лучше, чем другие производства многих аскоспор в течение короткого периода времени. Другие штаммы могут давать лишь низкий процент аскоспор. Это не имеет никакого влияния на эксперимент, если достаточно истинного сумки могут быть выбраны. Кроме того, штаммы по-разному реагируют во время клеточного пищеварения стены и необходимо эмпирически регулировать время инкубации в тетрады сока.

При выборе клеток с маркерами желаемого, нужно только выбрать те, которые приходят из сумки, где модель роста всех аскоспор соответствуют теоретической модели роста и от вскрытия, где подавляющее большинство всех аскоспор привести к ожидаемому росту узор.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Singer MSM System 200	Microscope	Singer Instruments	NA
D-sorbitol	Reagent	BioShop Canada	SOR508
Tris	Reagent	BioShop Canada	TRS001
Zymolyase 100T	Reagent	Seikagaku Corporation	120493
Yeast extract	Reagent	BioShop Canada	YEX401
Peptone	Reagent	BioShop Canada	PEP 403
D-glucose	Reagent	BioShop Canada	GLU501
Yeast nitrogen base	Reagent	BioShop Canada	YNB406
Bio-tryptone	Reagent	BioShop Canada	TRP402
Sodium chloride	Reagent	BioShop Canada	SOD002
Potassium acetate	Reagent	BioShop Canada	POA 301
Agar	Reagent	BioShop Canada	AGR003
Adenine sulfate	Reagent	BioShop Canada	ADS201
L-uracil	Reagent	BioShop Canada	URA 241
L-tryptophan	Reagent	BioShop Canada	TRP 100
L-histidine	Reagent	BioShop Canada	HIS 200
L-arginine	Reagent	Amresco	0877-100G
L-methionine	Reagent	BioShop Canada	MET 222
L-tyrosine	Reagent	BioShop Canada	TYR 333
L-isoleucine	Reagent	BioShop Canada	ISO 910
L-valine	Reagent	BioShop Canada	VAL 201
L-lysine	Reagent	BioShop Canada	LYS 101
L-phenylalanine	Reagent	BioShop Canada	PHA 302
L-glutamic acid	Reagent	BioShop Canada	GLU 202
L-threonine	Reagent	BioShop Canada	THR002
L-leucine	Reagent	BioShop Canada	LEU 222