Summary
En este artículo se presenta un protocolo general para medir la duración de la vida de los nematodos mantienen en medios sólidos con UV-muertos alimentaria bacteriana.
Abstract
El envejecimiento es un proceso degenerativo caracterizado por un deterioro progresivo de los componentes celulares y orgánulos que resulta en la mortalidad. El nematodo
Protocol
Parte 1: Preparar nematodo crecimiento de los medios (NGM) placas
En esta sección se describe la preparación de los platos NGM sólida para su uso en el experimento de vida. Un experimento de vida útil básica requiere dos tipos de placas: las placas estándar NGM, que no contienen aditivos, y las placas Amp / FUDR, que tienen la ampicilina (Amp) y fluorodesoxiuridina (FUDR) añadido a la NGM. La ampicilina se utiliza para prevenir la contaminación bacteriana externa. FUDR inhibe la división celular, reduce la producción de huevos, y evita que los huevos de incubar. El uso de FUDR para el análisis de la longevidad no afecta vida adulta y elimina la necesidad de transferir los gusanos cada pocos días con el fin de separarlos de la larva en crecimiento. Ambos tipos de placas se siembran con E. coli OP50 bacterias, que posteriormente asesinado por la exposición a los rayos UV.
- Prepare NGM (véase la Sección 5 de la receta y notas de almacenamiento) y placas de identificación de Petri. Usted tendrá una placa de Petri de 60 mm por cada 10 ml de NGM. Si usted está comenzando con NGM previamente preparados sólidos, continúe con el paso 1.2. Si usted está comenzando con NGM recién autoclave, vaya al paso 1.4.
- Fundir completamente NGM sólida en el microondas en alto en 30 pulsos de segundo. Los medios de comunicación remolino entre los pulsos para evitar burbujas de gas a presión se acumule.
- NGM en lugar de líquido 55 ° C baño de agua o en el banco que se enfríe.
- Una vez NGM alcanza los 55 ° C añadir 33 l de FUDR 150 mm y 100 L de 100 mg / ml de ampicilina por cada 100 ml NGM (por Amp / FUDR placas) y agitar para mezclar. Para placas NGM sin medicamentos adicionales vaya directamente al paso 1.5.
- Utilizando una técnica estéril, pipeta de 10 mL en cada NGM 60 mm placa de Petri. Evitar la formación de burbujas, si es posible. Si se forman burbujas, que se pueden hacer estallar con una punta de la pipeta.
- Deja los platos en la mesa con tapa para permitir que el NGM para solidificar y secar. Si es posible, dejar las placas en el banco durante 2 días antes de la adición de bacterias, pero un día va a funcionar si las placas son necesarios antes.
- El día antes de terminar de secar los platos, líquido de semilla cultura LB con una colonia de una racha dulce de E. coli OP50 bacterias en agar LB. Usted debe preparar por lo menos 1 ml de una noche a la mañana OP50 cultura por placa de 60 mm.
- Lugar OP50 cultura en 37 ° C agitador y permitir que las bacterias crecen durante la noche (la cultura debe llegar a la saturación).
- Pellet OP50 bacterias al girar a 3.500 g durante 10 minutos.
- Eliminar el 90% de las bacterias sobrenadante y resuspender a concentrar la cultura de 10x.
- Pipetear 100 L de 10x concentrada OP50 la cultura en el centro de las placas NGM solidificado. Placas de agitar suavemente para extender cultivo de bacterias, si es necesario (lo ideal bacteria debe cubrir el área central de la NGM sin llegar cerca de las paredes de placas). Trate de no tocar la punta de la pipeta a la superficie de la NGM, como defectos en la superficie de los medios de comunicación permiten que las lombrices se introducen en la NGM.
- Deja los platos en la mesa durante la noche para permitir que la cultura bacterias se seque en la NGM sólida (por lo general tarda aproximadamente 24 horas).
- Una vez seco, exponer la superficie de las placas a una dosis UV suficiente para detener el crecimiento de las bacterias. Si estás utilizando un Stratalinker UV Stratagene 2400:
- Coloque las placas en la Stratalinker y quite las tapas
- Cierre la puerta y encender el Stratalinker
- "Energía" de prensa
- Introduzca '9999 'usando el teclado
- "Inicio" de prensa
- Las placas estarán expuestas a los rayos UV durante unos 5 minutos
- Las placas con las bacterias muertas por UV se pueden almacenar al revés a 4 ° C durante un máximo de un mes.
Parte 2: Realizar un huevo de tiempo por la que se adquieren a una edad sincronizado población de animales
En esta sección se genera una población de gusanos con una escotilla común-la fecha. Esto se logra al permitir que los adultos reproductivamente activas para poner los huevos en un plato por un período definido de tiempo y permitiendo que los huevos para desarrollarse.
- (Opcional) Transferencia de aproximadamente 20 gusanos adultos jóvenes a una placa de NGM fresco sin FUDR. Deja las placas a 25 ° C a fin de que los gusanos se propaguen y que comer a través de todo el alimento de bacterias. Después de la comida bacteriana que se ha consumido gusanos recién nacidos entrará en la etapa de crecimiento arrestado Dauer. Usted empezará a ver larva Dauer todo dentro de una semana, dependiendo de cómo muchos gusanos que transfiera a la placa inicial. Dauer larvas se pueden utilizar para los próximos pasos para un máximo de un mes.
- (Opcional) Transferencia de 20 a 30 Dauer larva de una placa de NGM fresco sin FUDR. En presencia de alimentos larva Dauer se convertirán en adultos reproductivamente activas dentro de 2 días y siguen siendo reproductivo activos por unos pocos días después a 25 ° C.
- Transferencia de 10 a 15 adultos reproductivamente activos a una placa de NGM fresco sin FUDR. Este plato se conoce como la puesta de huevos tiempo (TEL) de placas.
- Deje la placa de TEL a 25 ° C durante 6 horas a fin de que tque el tiempo los gusanos para poner sus huevos.
- Eliminar los gusanos adultos de la placa TEL. Placa puede ser inspeccionada visualmente para detectar los huevos antes de retirar los adultos. Si los gusanos no han establecido un número suficiente de huevos de la placa de TEL se puede dejar a 25 ° C hasta un total de 24 horas antes de la eliminación de los gusanos adultos.
- Coloque la placa de TEL a 20 ° C hasta que los huevos han eclosionado y los gusanos se han desarrollado hasta la etapa larval L4 (esto por lo general, toma 2 días de tipo silvestre de C. elegans, pero puede tomar más tiempo para las cepas con fenotipos de desarrollo lento).
Parte 3: Puntuación de los animales vida
En esta sección seguimos la edad sincronizado población de gusanos en la parte 2 hasta que mueren. Los gusanos se mantienen en Amp / FUDR placas para evitar que la producción de huevos y la contaminación bacteriana y se considera muerto cuando no responden a los estímulos externos.
- Transferencia L4 larva de semillas Amp / FUDR placas. Para cada cepa o afección que se estudia, es típico para configurar 2-3 placas con 25 a 30 gusanos por placa. Imágenes de la C. etapas de la vida elegans se proporcionan para los de referencia (Figura 1) 1.
- Lugar Amp / FUDR placas a 20 ° C durante 24 horas.
- Después de 24 horas, visualmente evaluar los gusanos, los medios de comunicación, y las bacterias. Transferencia de gusanos a un nuevo amplificador / FUDR placas si alguno de los siguientes se observa:
- Los gusanos se han comido la mayoría de los alimentos bacteriana. A principios de los gusanos experimento duración de la vida tendrá que ser transferido 1 a 2 veces a la semana para evitar que las bacterias están agotando.
- Un número significativo de larvas presentes. Esto es generalmente un indicio de que los gusanos fueron trasladados a las placas Amp / FUDR como adultos jóvenes en lugar de L4s y fueron capaces de poner unos huevos antes de la FUDR entró en vigor. El FUDR suele prevenir las larvas de llegar a ser adultos completa, pero de vez en cuando unos pocos se convierten en adultos y se confunden con los animales de experimentación.
- Bacterias vivas / cada vez se observan. En general, la combinación de amplificador y UV-matar se asegurará de que ninguna bacteria viva contaminar el experimento, pero a veces ocurre.
- El crecimiento de hongos que se observa en los medios de comunicación. Si se detecta a tiempo, el crecimiento de hongos por lo general se puede cortar con una punta de la pipeta o una espátula. Una vez que crece hasta ser más grande que unos pocos milímetros de diámetro, por lo general es más fácil de transferir a los gusanos a una nueva placa.
- Utilizar las posibilidades que la disección, determinar si cada gusano está vivo o muerto.
- Golpear suavemente la placa. El gusano está vivo si se mueve en respuesta a la interceptación.
- Si el gusano de ellos no responden a tocar la placa, zoom en la región de la cabeza.
- Golpee suavemente la cabeza del gusano con el pico de platino de transferencia. Puntuación del gusano como muerta si no responde moviendo su cabeza.
- Gusanos muertos pueden ser retirados de la placa.
- Anote la fecha y el número de gusanos que están vivos y los muertos.
- Volver placas a 20 ° C.
- Repita los pasos 3.3 a 3.6 cada 2 ó 3 días hasta que todos los gusanos han muerto.
Parte 4: Los resultados representativos.
Los datos en bruto producido por un experimento de nematodos vida es una lista de fechas con los números correspondientes de los gusanos que están vivos y los muertos de cada cepa ensayada. El número de gusanos que se mueren cada día suele ser invertido para calcular la proporción de gusanos vivos en todos los días (Figura 2A), que se representa gráficamente como una curva de supervivencia (Figura 2B, el día de la puesta de huevos tiempo se considera el día 0 ). La esperanza de vida para cada individuo del gusano en el estudio se puede calcular a partir del recuento de los gusanos que mueren cada día y se utiliza para el cálculo de tiempo de vida media y la mediana para la comparación entre las cepas. El recuento del número de gusanos vivos en cada día no se utiliza directamente en el análisis de vida útil. Gusanos mantenidos en medios sólidos de vez en cuando 'huir', o se arrastran hacia arriba la pared de la placa o por debajo de la media. El número de gusanos vivos en cada día se puede utilizar para determinar cómo los gusanos, muchos huyeron a lo largo del experimento. Gusanos que huyen normalmente se extirpan de análisis. Como punto de referencia, la duración de vida típica de la mediana de N2, el C. elegans cepa de tipo salvaje, mantenidos en el UV-mató a las bacterias a 20 ° C es de aproximadamente 25 días como medida de huevo.
Parte 5: Soluciones
| Nematodo de crecimiento de los medios (NGM), 100 ml: | |
| Combine: | |
| 0,3 g | NaCl |
| 0,25 g | Peptona |
| 2 g | Agar |
| Autoclave durante 40 minutos y dejar enfriar a 55 ° C, a continuación, añadir: | |
| 100 L | 1 M MgSO 4 |
| 100 L | 5 mg / ml de colesterol |
| 100 L | 1 M de CaCl2 |
| 1.625 ml | 1,5 M pH 6,0 KPI |
| NGM líquido puede ser utilizado de inmediato para verter en las placas o se deja solidificar y se almacenan a largo plazo a temperatura ambiente | |
| Caldo Luria (LB), 1 litro: | |
| 10 g | BactoTryptone |
| 5 g | Extracto de levadura |
| 10 g | NaCl |
| 10 ml | 1 M Tris pH 8,0 |
| 1 L | agua desionizada |
| Autoclave y almacenar a temperatura ambiente. | |
| 1 M MgSO 4, 300 ml: | |
| 73,95 g | MgSO4 |
| 300 ml | agua desionizada |
| Autoclave y almacenar a temperatura ambiente. | |
| 5 mg / ml de colesterol, 200 ml: | |
| 1 g | colesterol |
| 200 ml | 100% de etanol |
| Filtro de esterilizar y almacenar a temperatura ambiente. | |
| 1 M CaCl 2, 500 ml: | |
| 27,75 g | CaCl2 |
| 500 ml | agua desionizada |
| Filtro de esterilizar y almacenar a temperatura ambiente. | |
| 1,5 M pH 6,0 KPI, 1L: | |
| Combine: | |
| 31,4 g | KPI dibásico |
| 179,6 g | KPI monobásico |
| 850 ml | agua desionizada |
| Calor mientras se mezcla para permitir KPI en disolverse. Ajustar el pH a 6.0 con NaOH 10 N. | |
| Añadir agua desionizada hasta 1 L. | |
| Autoclave y almacenar a temperatura ambiente. | |
| 1 M Tris, pH 8,0: | |
| 60,57 g | Tris |
| 400 ml | agua desionizada |
| Ajustar el pH a 8.0 con HCl. | |
| Añadir agua desionizada hasta 500 ml. | |
| Filtro de esterilizar y almacenar a temperatura ambiente. | |
| 150 mM fluorodesoxiuridina (FUDR), 10 ml: | |
| 0,3693 g | FUDR |
| 10 ml | agua destilada estéril |
| Almacenar a -20 ° C. | |
| 100 mg / ml de ampicilina (Amp), 10 ml: | |
| 1 g | Ampicilina |
| 10 ml | agua destilada estéril |
| Almacenar a -20 ° C. | |
| 50 mg / ml carbenicilina (CARB), 10 ml: | |
| 500 mg | Carbenicilina |
| 10 ml | agua destilada estéril |
| Almacenar a -20 ° C. | |
| 1 M isopropílico β-D-tiogalactopiranósido (IPTG), 10 ml: | |
| 2,38 g | IPTG |
| 10 ml | agua destilada estéril |
| Almacenar a -20 ° C. | |
Figura 1. Imágenes de campo claro de la C. elegans etapas de la vida, incluyendo huevos, de los cuatro estadios larvales (L1 - L4) y adulto. Todos los paneles muestran hermafroditas, excepto la esquina inferior derecha, que muestra a un hombre adulto (Imagen de madera (1988)).
Figura 2. Los resultados representativos de una C. la vida elegans experimento lapso comparar salvaje N2 tipo de cepa a cepa que contiene una mutación en el gen daf-2. (A) Una tabla que muestra los datos recogidos, incluyendo el número de días desde que los gusanos fueron los huevos, el número de gusanos muertos observados cada día, y el porcentaje de la muestra original que permanecen vivos en cada día (calculada a partir de los recuentos diarios de los gusanos muertos) . (B) Supervivencia curvas correspondientes a los datos de vida útil previsto en (A).
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Discussion
El control genético de la longevidad se ha estudiado extensamente en C. elegans, en gran parte debido a la facilidad y rapidez con que puede ser tiempo de vida determinado. El protocolo discutido en este artículo se describe un marco básico para la obtención de datos reproducibles esperanza de vida en C. elegans y también se puede aplicar a las especies relatednematode. 2 Al hacer algunos cambios sencillos estos procedimientos pueden ser adaptados para medir duración de la vida bajo una variedad de condiciones. Aquí vamos a discutir algunas variaciones comunes, incluyendo bacterias vivas, el ARN de interferencia (ARNi), la restricción dietética por la privación de bacterias, y NGM libre de drogas.
Probablemente, la variación más común de este protocolo es el mantenimiento de los gusanos de bacterias vivas. Esto se puede lograr haciendo algunos cambios menores. En primer lugar, cambiar el procedimiento para la siembra de las placas con las bacterias (medidas 1.7 a través de 1,13). En lugar de crecer OP50 culturas a la saturación, para crecer mitad de la fase de registro y una pipeta 200 l en los platos directamente del cultivo líquido. Permitir que las bacterias crecen en las placas durante la noche y se omite la exposición a los rayos UV. Ampicilina deben ser excluidos de las placas con FUDR. Una ventaja de utilizar bacterias vivas es que los gusanos no tienen que ser transferidos con la frecuencia de las nuevas placas, ya que los alimentos bacteriana viva y en crecimiento. La desventaja de los alimentos bacteriana en vivo es que OP50 es patógeno para C. elegans. 3 gusanos crecido en bacterias vivas tienen una vida más corta que viven los gusanos crecen en UV-bacterias muertas, 3, que podrían enmascarar los fenotipos duración de la vida asociados con el envejecimiento. La mediana de duración de la vida en bacterias vivas es de aproximadamente 20 días.
Knock por RNAi se logra fácilmente en C. elegans mediante la modificación de su alimento de bacterias para que produzca ARN de doble cadena que corresponde al gen que se tiró al suelo. Dos bibliotecas RNAi bacteriana están disponibles que cubren más del 90% de los marcos de lectura abierta en el C. elegans genoma. 9.4 Para utilizar RNAi en el contexto de la vida, sustituir el OP50 bacterias con el clon de RNAi de interés y siga las modificaciones expuestas en el párrafo anterior para medir la duración de la vida en bacterias vivas. Las bibliotecas de RNAi utilizar un sistema basado en el plásmido de expresión. El plásmido se ha seleccionado para el uso de un cassette de resistencia a carbenicilina y la expresión del ARN de doble cadena es inducida por isopropil β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Tanto carbenicilina y IPTG se deben incluir en las placas de NGM. Modificar el paso 1.4 mediante la adición de 100 L 1 M IPTG y 50 l 50 carbenicilina mg / ml por 100 ml NGM a ambos tipos de placas. La ampicilina no necesita ser añadido a cualquier tipo de plato, ya carbenicilina cumple el mismo papel.
La restricción dietética es la intervención más ampliamente estudiados para retrasar el envejecimiento en todas las especies evolutivamente divergentes. En C. elegans, la extensión máxima duración de la vida en el medio sólido se observa cuando la fuente de alimento de bacterias se elimina por completo durante la edad adulta, una forma de restricción dietética denomina privación bacteriana (EB). 9, 10 Para medir la duración de la vida en el contexto de la BD, hacer dos modificaciones para el protocolo anterior. En primer lugar, preparar un tercer tipo de plato. Estas placas deben ser idénticas a las placas Amp / FUDR excepto que carecen de la fuente de alimento de bacterias. En segundo lugar, modificar la Parte 3 para incluir un paso adicional entre el paso 3.2 y paso 3.3. En el día cuarto de la edad adulta (4 días después de la transferencia de las larvas L4 de Amp / FUDR) la transferencia de los gusanos de BD Amp / FUDR placas que carecen de las bacterias. Una de las complicaciones asociadas con esta forma de restricción en la dieta es la tendencia de los gusanos para huir. Ante la falta de comida a los gusanos no se queda cerca del centro de la placa, sino que aumentará su área de exploración en busca de alimento. Como resultado, una mayor fracción de los gusanos se arrastran por las paredes de la placa y se secan. A menudo vemos a un 50% a 70% de los animales huyen tras ser trasladado a las placas de BD. Para solucionar este problema, comience con el triple de muchos gusanos a fin de tener un número importante que queda en los platos después del vuelo. BD también se puede combinar con alimentos con bacterias vivas sin modificaciones adicionales, o RNAi con una modificación adicional. Para BD con RNAi, un antibiótico adicional se debe agregar a los platos sin bacterias para evitar que las bacterias transfieren con los gusanos de crecimiento y proporcionar una fuente de alimento no deseado. Dos ejemplos son la tetraciclina y kanamicina, ya sea de los que se pueden añadir a los platos sin comida FUDR bacteriana durante el paso 1.4. BD también se puede iniciar desde los 2 días de la edad adulta o tan tarde como 14 días después de la edad adulta, con un impacto significativo sobre la esperanza de vida 10.
La modificación final que vamos a discutir es la medición de duración de la vida en las placas de NGM sin medicamentos adicionales (por ejemplo, la ampicilina o FUDR). Esto se puede lograrsimplemente no la adición de las drogas a la NGM durante el paso 4 y la adición de un paso adicional en la parte 3. Sin FUDR los gusanos seguirá poniendo huevos y la producción de larva. Durante su etapa reproductiva (aproximadamente la primera semana de la edad adulta) todos los gusanos experimentales tienen que ser transferidos a nuevas placas cada 2 días para separarse de sus hijos.
C. elegans es hermafrodita principalmente con la aparición poco frecuente de los varones. La expectativa de vida se mide normalmente por los hermafroditas, sino también puede ser medida por los hombres. Hay dos problemas relacionados con el trabajo con varones C. elegans. La primera es la adquisición de una gran cantidad de gusanos machos, como hermafrodita autofecundación produce una fracción muy pequeña de los hijos varones (0,1%). 11 Una vez que una población con gusanos machos se alcanza, masculino / hermafrodita apareamiento produce aproximadamente el mismo número de hombres y hermafroditas, siempre y cuando los gusanos se mantienen en la presencia de alimentos. 12 poblaciones masculina puede ser ordenado desde el Centro de Genética Caenorhabditis o visual generado por la detección de los hombres fundadores producido a partir de hermafroditas auto-fecundación. El segundo desafío es el comportamiento masculino basura. Ante la falta de comida o parejas potenciales (hermafroditas), gusanos machos entrar en el modo de búsqueda de comportamiento que involucra un amplio rango de movimiento. 13 cuando se mantiene en las placas de este comportamiento resulta en una gran parte de los gusanos que huyen de las paredes de placas y la desecación . El método general para hacer frente a esta dificultad es, simplemente, comenzar con los hombres basta con que un número importante siguen siendo los más después de haber huido.
Aparte de vida, una común asociado a la edad fenotipo es la acumulación de lipofuscina. La lipofuscina es un desecho celular compleja que no puede ser degradada que se acumula en las células con la edad y se utiliza como un marcador biológico de envejecimiento en C. elegans. 14, 15 y fluorescencia lipofuscina se pueden visualizar fácilmente en el C. elegans utilizando el canal DAPI de un microscopio de fluorescencia (Figura 3). Lipofuscina acumulación puede ser visualizada en los gusanos que se anotaron para vida directamente sobre las placas de NGM, logrando la recolección de un fenotipo útil secundaria en paralelo con la esperanza de vida.
Además de la duración de la vida, el protocolo descrito en este artículo también se puede utilizar para marcar la progresión fenotípica de edad asociada a la parálisis en C. elegans modelos de la enfermedad proteotoxicity. 16 Cuando un gusano se paraliza se vuelve incapaz de gatear a través de la placa, pero aún puede mover la cabeza. Un gusano se califica como paralizado si no se mueve en relación con la NGM en respuesta a la placa perforada o pinchar con un pico de transferencia de platino, pero se mueve su cabeza. Los gusanos que se mueren por lo general conservan el puntaje parálisis (parálisis o paralizado no) que se dieron durante la observación en vivo más reciente. Es importante destacar que, incluso de tipo salvaje C. elegans se paralizan con la edad avanzada. Por esta razón es la parálisis por lo general no anotó para los gusanos de más de aproximadamente 20 días, más allá de este punto se hace difícil distinguir entre la parálisis causada por el envejecimiento normal y la parálisis causada por la progresión de la enfermedad proteotoxicity.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una Glenn / AFAR avances en la concesión de Gerontología y Subvenciones del NIH 1R01AG031108-01 a MKGS es apoyado por el NIH formación conceder P30AG013280. MK es una Ellison Medical Foundation de Nueva Académico en el envejecimiento.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Reagent | Fisher Scientific | DF0145-17-0 (214530) | |
| Ampicillin | Reagent | MidSci | 0339 | |
| BactoTryptone | Reagent | Fisher Scientific | DF0123-17-3 (211705) | |
| BactoPeptone | Reagent | Fisher Scientific | DF0118-17-0 (211677) | |
| CaCl2 | Reagent | Fisher Scientific | NC9699248 (1332-01) | |
| Carbenicillin | Reagent | Gold Biotechnology | C0109 | |
| Cholesterol | Reagent | Sigma-Aldrich | C75209 | |
| Fluorodeoxyuridine (FUDR) | Reagent | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| Isopropyl β-d-Thiogalactopyranoside (IPTG) | Reagent | Gold Biotechnology | I2481C5 | |
| KPi Dibasic | Reagent | Fisher Scientific | 5087862 (3252-01) | |
| KPi Monobasic | Reagent | Fisher Scientific | 5087861 (3246-01) | |
| MgSO4 | Reagent | Fisher Scientific | NC9561800 (2500-01) | |
| NaCl | Reagent | Fisher Scientific | S251 | |
| Tris | Reagent | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Yeast Extract | Reagent | Fisher Scientific | DF0886-17-0 (288620) |
References
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