تصور لايف ذبابة الفاكهة الدبقية العصبية والعضلية ، تقاطع مع الأصباغ نيون
Summary
صفنا السمات الهيكلية للنقاط الاشتباك العصبي الدبق العصبي العضلي في نسيج الرواية إعداد الداخل التدريجي من استخدام يرقات الذباب يعيش الأصباغ الفلورية مع المجهري متحد البؤر. نحن المسمى محطات عصبون تعيش مع الأجسام المضادة الأولية الفلورسنت لHRP ، وكذلك تصور الفضاء perisynaptic مع Dextrans الفلورسنت.
Abstract
مشروعنا تحديد هياكل GFP الدبقية المسمى في المشبك العصبي العضلي يرقات ذبابة النامية. للنظر في وضع المشابك العصبية الدبقية – العضلات العيش ، طورنا إعداد الأنسجة اليرقات التي كانت ملامح يرقات حية سليمة ، ولكن أيضا كان الخصائص البصرية جيدة. هذا المستحضر الجديد يسمح أيضا للحصول على perfusates المشبك. استخدمنا يرقات الذباب ، منغمسين في هذه الدملمف الاصطناعي ، واسترخاء الجسم بشكل طبيعي الانقباضات الإيقاعية التي تقشعر لها الأبدان منهم. نحن المقبل تشريح قبالة شرائح الخلفي من كل الحيوانات والحشرات بدبوس حادة دفعت أجزاء الفم الى الوراء من خلال تجويف الجسم. مقلوبة هذه اليرقات جدار الجسم ، مثل تحول جورب من الداخل إلى الخارج. أكملنا تشريح مع مقص تشريح غاية في الدقة وبالتالي يتعرض الجانب الحشوي للعضلات جدار الجسم. وأعرب الهياكل الدبقية في NMJ GFP غشاء المستهدفة تحت سيطرة المروجين الدبقية محددة. وأعرب الغشاء بعد المشبكي ، الاشتراكية السوفياتية (شبيكات تحت المشبك) في العضلات المستهدفة synaptically dsRed. نحن في حاجة لتسمية المحطات تماما الخلايا العصبية الحركية ، والجزء الثالث من المشبك. للقيام بذلك طبقنا الأجسام المضادة الأولية لHRP ، مترافق إلى انبعاث flurophore بعيدة الحمراء. لاختبار خصائص صبغة نشر في الفضاء perisynaptic بين محطات الخلايا العصبية الحركية والاشتراكية السوفياتية ، وطبقنا حل من جزيئات كبيرة ديكستران مترافق لانبعاث flurophore بعيدة الحمراء والصور التي تم جمعها.
Protocol
Discussion
يسمح هذا الإجراء على المدى الطويل من العيش التصوير البروتينات وصفت وعمليات الخلية. والإعدادية في الأنسجة وصفنا الوضع الطبيعي لديها سليمة وأداء الجهاز العصبي المركزي ، والجهاز العصبي المحيطي للدوائر المنعكس. هذا النسيج الإعدادية والمزايا على مستوى يرقات ?…
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل وCIHR NSERC. نود أن نعترف Jusiak بارب للمساهمة في خلق سلالات ذبابة معربا عن dsRed SSR المسمى (خط BJ) ، وبيو UBC مرفق التصوير.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| HL-6: Artifical Drosophila hemolymph, with 5 mM L-glutamate added, and 2 mM Calcium. | Reagent | NA | NA | 5 mM L-glutamate blocked muscle contractions. We used Molecular grade L-Glutamate (Sigma). 2 mM Calcium is close to physiological Calcium levels in natural larval hemolymph. References: Macleod et al 2002 and Macleod 2004 |
| Dextran, Alex Fluor 680; 10,000 MW, anionic, fixable | Reagent | Molecular Probes/Invitrogen | D34680 | Use a small volume perfusion chamber to keep the total volume of dye low |
| Anti-HRP-CY5 conjugate (goat) | Reagent | Jackson ImmunoResearc | 123-175-021 | Dilute 2.0 mg into 1 ml ddH2O; aliquot into 4 microliter aliquots. Freeze at –20C. Dilute one aliquot into 100 microliters of HL-6 |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Reagent | Molecular Probes/Invitrogen | A10475 | We prepared a total of 80 micro liters of conjugated primary antibody, and stored as 2 microliter aliquots. We diluted each aliquot into 100 microliter of HL-6 for labeling. |
| Custom Formulated Objective Oil, refractive index 1.3379 | Reagent | Cargill Labs | Custom Formulated | |
| Ultra Fine Forceps | Tool | Fine Science Tolls | 11252-23 or 11295-20 | |
| Spring scissors | Tool | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Ultra fine clipper scissors | Tool | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Perfusion Chamber RC 20 Series | Tool | Warner Instruments | 64-02222 | |
| Spinning Disc confocal | Microscope | Quorum | Quorum Wave FX | Mounted on a Leica DMI6000 Inverted Microscope |
References
- Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M., Atwood, H. L. Synaptic Vesicles: Test for a role in presynaptic Calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
- Macleod, G. T., Hegstro, M., Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast Calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiology. 88, 2659-2663 (2002).
- Morales, M., Ferrus, A., Martinez-Padron, M. Presynaptic calcium-channel currents in normal and csp mutant Drosophila peptidergic terminals. Eur J Neurosci. 11, 1818-1826 (1999).
- Stork, T., Engelen, D., Krudewig, A., Silies, M., Bainton, R. J., Kla¨mbt, C. Organization and Function of the Blood–Brain Barrier in Drosophila. J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).
