Summary
我々は、共焦点顕微鏡で蛍光染料を使用して、ライブハエの幼虫の小説インサイドアウトの組織調製物におけるグリア - 神経筋シナプスの構造的特徴を説明した。我々は、HRPの蛍光灯の一次抗体とのライブニューロンの端末をラベル付けし、また蛍光デキストランでperisynapticスペースを可視化。
Abstract
私たちのプロジェクトは、開発途上幼虫のフライ神経筋シナプスでGFP標識したグリアの構造を同定した。ライブグリア - 神経筋シナプスの発達を見て、私たちは生きて無傷の幼虫の特徴を持っていた幼虫の組織の準備を開発するだけでなく、良好な光学特性を持っていた。この新しい製剤は、シナプスへの灌流液のアクセスを可能にした。我々は、ハエの幼虫を用い、人工体液中のそれらを浸し、そして、それらを冷却することによって、正常なリズム体の収縮を緩和。次に、各動物の後部のセグメントをオフに切開し、鈍虫ピンで体腔を後方に口の部分をプッシュ。これは靴下裏返しにして回すように、幼虫体壁をeverted。我々は、超微細解剖鋏で解剖を完了したので、体壁筋の内臓側を露出。 NMJにおけるグリアの構造は、グリア特異的プロモーターの制御下にGFPをターゲット膜を表明した。シナプス後膜、筋肉のSSR（シナプス胞体）がシナプスDsRedを対象と表明した。我々は急性運動ニューロンの端末、シナプスの第三部にラベルを付ける必要がありました。これを行うために、我々は、遠赤色発光flurophoreに結合した、HRPに一次抗体を適用する。運動ニューロンの端末とSSRの間にperisynaptic空間に染料の拡散特性をテストするために、我々は、遠赤色発光flurophoreと収集した画像に結合した大規模なデキストラン分子の溶液を適用する。
Protocol
パート1：組織の準備
- 私たちの目標は、神経系が損なわれていないハエの幼虫の組織の準備ですが、体壁筋の内側表面は人工の血リンパにさらされている、と近くに良い光学用顕微鏡のカバーガラスに配置することができます。言い換えれば、幼虫の準備裏返し。
従来の組織の準備が、カットピニングと体壁の筋肉をストレッチし、時には神経系の一部を除去を伴うので、私たちは異なるアプローチを必要としていました。
我々は構造的な特徴とシナプスの時間的構造変化をよく見て取得したいので、我々は、インサイドアウトの動物が欲しくて、私たちは神経系を維持するようにしたかった。我々はまた、組織をストレッチを避けるためにしたかった、と筋肉がけいれんし、私たちの画像を台無しにするようになるストレッチ受容体を、活性化する。 - 手始めに、動物を上演。第三幼虫を餌とサード幼虫をさまようことは我々がW3幼虫に説明していきますので、解剖に大きく、簡単にできます。この動物は、タビー表現型を有し、そして広いですので、裏返すことは容易である。
我々は、W3幼虫を含めて、我々は積極的にクロールを見たことが幼虫をのみを使用していました。 - 蒸留水のペトリ皿の中で非常に柔らかいペイントブラシでウジの表面を清掃してください。クリーン幼虫は、より良い光学系を持ち、洗浄が細菌を減らします。
- 約3mlの氷冷HL - 6、および人工血リンパの小さなペトリ皿に動物を譲渡する。動物が変化しない、と（約5分）リラックスするまで氷上に皿を置く。
- 片手およびその他の春のはさみで非常に微細な先端の鉗子を保持する。私は私の支配的な手でハサミを使用してください。体壁を越え圧力をequlibrateにはさみが付いているボディの壁に小さな穴をあけます。
- 皿の底を下に鉗子で軽く動物を持って、後部つのセグメントを切断。内臓を離れて摘出し、脂肪体は、おそらく、体腔外に移動します。また、この組織を切り取る。
- 細かいピンセットでシャーレの底部に対して幼虫を保持する。 （鈍先端）の＃0昆虫ピンを持ち、幼虫の口の部分に対してそれを押す。裏返して、靴下を回っているような体腔を通じて口の部分を押してください。
- 組織インサイドアウトでは、図のようになります：下記。超微細解剖ツールを使用して、体壁から脂肪体とtrachiolesを離れて分析する。本当にハードtrachiolesを引っ張ったり、神経系を切断しないようにしてください。 trachiolesをリッピングすると体壁の筋肉の穴をリッピングされます。
あなたができる限り多くの脂肪体を取り外します。これらの構造の両方は、あなたの組織の光学的品質を混乱させる。この準備を行う前にコーヒーをスキップしたいことがあります。 - 終了したら、筋肉は半透明、不透明または白ではないとなります。あなたがグルタミン酸なしHL - 6に組織の準備を置く場合は中枢神経系における運動パターンジェネレータが作業しているので、室温で、それは可能性がリズミカルに収縮したりします。
明らかに契約、または不規則に収縮体壁筋でプレップを使用することは避けてください。
体壁から無傷の内部が容易に背側と腹側の中心線に沿って半分に折るする傾向がある、準備が視覚化するために左または右の"半動物"を与えるように。 - 1.9などのワーナー室のような少量の商業室、、またはブリッジカバースリップの配置と顕微鏡用スライドのいずれかで組織をマウントします。取り付け組織についての提案は、パート3を参照してください。
パート2：HRPに対する蛍光標識一次抗体と神経ブートンラベリング。
- ペトリ皿上にドロップでHL - 6でHRPに対する蛍光標識一次抗体の50マイクロリットルを入れて。染浴の裏返し体壁の準備を浸す。あなたは約5分後にニューロンの末端標識が見えますが、完全で明るいラベルのために、10〜20分間インキュベートすることがあります。
- 室温でHL - 6の10〜30秒のために染料を洗い流す。非結合色素は、そのリンスサイクルは積極的である必要はなく、すぐにオフリンス。
- 必要に応じて色素濃度とインキュベーション時間を変化させる。
パート3：デキストランflurophore共役とPerisynapticスペースラベリング
- HL - 6で希釈した蛍光共役デキストランの染料を希釈する。我々の目的のためによく働いた濃度であった。
- あなたがあなたの細胞外空間へのへの色素のアクセスのタイミングが心配されていない場合は、"ブリッジ"カバースリップ（パート4を参照）に染料の20マイクロリットル滴を入れて、染浴の準備を入金。
第4部：可視化のための組織を取り付け（共焦点顕微鏡による）。
あなたの準備を灌流する必要がない（短い観測）またはHL - 6小入浴のボリュームを保持する場合は、ダブルブリッジされたスライドのメソッドを使用します
あなたの準備を灌流する場合、灌流チャンバーを使用してみてください。我々は、MOを使用ワーナーの楽器からdified商工会議所。
両方のフォローのための詳細。
ダブルブリッジスライドに準備をマウント。
- 非常にきれいな顕微鏡スライドを使用してください。スライド上に瞬間接着剤二つの四角い、18ミリメートル（＃1.5）カバースリップ。カバースリップの端との間の2 mmのギャップを残す。
- 接着剤が完全に乾燥させ、またはそれはあなたの準備の周りの水性媒体を介して奇妙なフィルムを形成します。
- カバースリップの端との間の幼虫インサイドアウトを置きます。幼虫が大きく、あなたの画像取得システムは、限られたピクセルの配列を持っている場合には、対角線上準備を配置する必要がある場合があります。
- 18ミリメートル＃1.5カバー、（非常にきれい）と組織をカバーしています。スライドは最小限のワセリンで、スリップに隣接する組織に貼付されて"トップ"カバースリップを付着する。
- 上部カバースリップ上に1.3379の屈折率（あなたがHL - 6を使用している場合）とカーギルカスタムの目標の油の滴を入れて、このアセンブリを裏返しにします。
- 目的に向かってあなたの顕微鏡、油側の組織のアセンブリを置き、そしてあなたの目的に焦点を当てる。
修正された灌流チャンバ内の組織の取り付け。 - RC 20室の床面を形成する接着剤1.5カバースリップ。 RC - 20の指示に従ってチャンバー内の組織を置きます。代わりに、チャンバーのための屋根を形成するためにカバースリップのNytexメッシュの一部を使用してください。
パート5：代表的な結果：
- インサイドアウトの組織の準備郭清のシーケンス：
W3幼虫、洗浄し（"タビー"表現型）（5.1.1）。 W3幼虫、解剖後2セグメント。あなたは、トランス体壁圧（矢印）で体腔から押し出さ脂肪体を見ることができます。解剖の前に体壁1分（5.1.2）で小さな穴を作ることによって内臓"噴火"を最小限に抑えるようにしてください。内臓と準備は裏返し準備（5.1.3）を回す前に解剖。準備（5.1.4）のルーメン内のピン（矢印）とほぼeverted準備、、。いくつかの脂肪体と接続されているtrachioles（5.1.5）で、筋肉が外側に今あり、キューティクルの内側にあります。ほぼすべての脂肪体と解剖trachioles（5.1.6）と完全に切除組織の準備。
- 幼虫のNMJで抗HRPを用いてラベリング住んでいます。グリア拡張子（アウト準備内側）と代表的なW3幼虫神経筋シナプス。運動ニューロンブートン端子はCy5との共役であるHRP（マゼンタ）、に対する一次抗体で標識されています。グリアのプロセスは、GFP（緑色）で標識されています。
- Perisynapticスペースは蛍光準備裏返しでアレクサ680デキストランで視覚化。グリアプロセス（緑）が膜を対象とGFPで標識されている。筋肉の表面（青色）で、ポストシナプスSSRは、DsRedタンパク質で標識されている。アレクサデキストラン（赤）の形態では、細胞外の領域に集中している。デキストラン染料はperisynapticスペースでドーナツ型のプールを形成している。デキストランのラベリングおよびDsRed標識されたSSRはグレースケールで表示されます。 perisynapticスペース（矢印）を強調する複数のドーナツ状の色素プールを注意してください。
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Discussion
この手順では、ライブ標識タンパク質や細胞プロセスの長期的なイメージングを可能にします。私たちが説明の現場組織の準備はそのまま機能しCNS、PNSと反射回路を持っています。この組織の準備は、幼虫の体壁の筋肉が引き伸ばされている標準の幼虫のフライ筋肉プロトコル、（これが外部に固定されている場合）上の利点があります。ストレッチングシナプス形態を歪曲し、反射ベースの収縮を引き起こすことができます。準備から私たちの内側には機械的に安定していた、とリアルタイムで細胞の変化の高分解能の分析を容易に非常に優れた光学系を持っていた。さらに、準備裏返しは時間と長い時間の経過とともにシナプス変化の許容される可視化するために、最大生存。
解剖時には、PNSやCNSの損傷を防ぐように注意してください。この損害賠償として気管筋細胞に裂けや引っ張りは避けてください。可能な限り緩和体壁の筋肉を保つ。 HL - 6と組織を冷却すると体壁の筋を弛緩させるとトランス体の壁の緊張を減らすことができます。人工体液中のカルシウム（2mMのは）グリア細胞の健康や形態に不可欠です。
イメージングは、安定した、非契約の筋肉組織で実行する必要があります。 5mMのグルタミン酸を効率的に神経調節誘発筋収縮をブロックしながら、カルシウム拮抗薬のニフェジピンが有用な代替可能性があります。ニフェジピンは、10マイクロモルのブロックで、ほとんどの（すべてではない）神経は、筋収縮を誘発。したがって、ニフェジピンのブロック神経伝達物質の放出に関連付けられているチャンネルよりもより効果的に筋肉の細胞膜上の電位依存性カルシウムチャネル、通常のNMJシナプス機能（Morralesら、1999）を許可しながら筋収縮をブロックする。
抗体標識の手順を使用して、我々は確実に抗HRP一次抗体によって認識されるニューロンの端末、上に発現して細胞外炭水化物残基のラベルが付いた。我々は蛍光体の様々な（我々の研究Cy5標識で）利用できるプリ共役ジャクソン研究所からの抗HRP抗体を使用して優れたラベルを、得た。このアプローチは、細胞外マトリックスの分子を標識する例えば、細胞外エピトープを認識する任意の一次抗体で使用するように適合させることができる。
コウノトリら2008年までに使用されるプロトコルの変更と相まってその場で "裏返し"組織の準備は、、細胞の拡散の障壁をプロービングする場合に便利です。蛍光デキストラン染料の拡散は、また、シナプスの裂け目のような細胞間スペース、内灌流液と薬剤エントリを計時し、視覚化するのに便利かもしれません。
蛍光デキストランの色素で、それは小さな体積の灌流チャンバーを使用することが重要です。あなたがイメージに求める構造をカバーする色素溶液の"厚い"境界層があまりにもある場合は、色素溶液ため色素注入スペースと周囲の構造の間のコントラストの不足、関心の特徴を不明瞭にすることがあります。
最後に、私たちの構造的な標識技術は生きている組織に適した高解像度イメージングシステムが必要です。長いワーキング長さ、高開口数63X水浸レンズ;とGFPを可視化するための適切なレーザやフィルタ、DsRedを、遠赤我々は、Volocityソフトウェア（即興）と一緒に回転するディスク共焦点顕微鏡を（クォーラム技術とパーキンエルマーシステム）を使用蛍光物質。イメージングのために我々は、63Xの水浸レンズと組み合わせて人工血リンパ、HL - 6、の屈折率を一致させるカーギルラボからカスタム策定顕微鏡対物油を使用。この油がなければ、屈折異常が顕著であったと画像の歪みをもたらした。私たちの現場の準備では、このようなAPI DeltaVisionスキャニング修復システムなど、他の3次元イメージングシステムで使用されることがあります。しかし、厚さ、生きている組織標本からの光散乱の高レベルを克服するために注意する必要があります。
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Acknowledgments
このプロジェクトは、CIHRとNSERCによって資金を供給された。我々はDsRedのラベルが付いたSSR（BJライン）、およびUBCバイオイメージング施設を表すフライ株の創造に貢献するためのバーブJusiakに感謝します。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| HL-6: Artifical Drosophila hemolymph, with 5 mM L-glutamate added, and 2 mM Calcium. | Reagent | N/A | NA | 5 mM L-glutamate blocked muscle contractions. We used Molecular grade L-Glutamate (Sigma).2 mM Calcium is close to physiological Calcium levels in natural larval hemolymph.References: Macleod et al 2002 and Macleod 2004 |
| Dextran, Alex Fluor 680; 10,000 MW, anionic, fixable | Reagent | Molecular Probes, Life Technologies | D34680 | Use a small volume perfusion chamber to keep the total volume of dye low |
| Anti-HRP-CY5 conjugate (goat) | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 123-175-021 | Dilute 2.0 mg into 1 ml ddH2O; aliquot into 4 microliter aliquots. Freeze at –20C. Dilute one aliquot into 100 microliters of HL-6 |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Reagent | Molecular Probes, Life Technologies | A10475 | We prepared a total of 80 micro liters of conjugated primary antibody, and stored as 2 microliter aliquots. We diluted each aliquot into 100 microliter of HL-6 for labeling. |
| Custom Formulated Objective Oil, refractive index 1.3379 | Reagent | Cargill Labs | Custom Formulated | |
| Ultra Fine Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11252-23 or 11295-20 | |
| Spring scissors | Tool | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Ultra fine clipper scissors | Tool | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Perfusion Chamber RC 20 Series | Tool | Warner Instruments | 64-02222 | |
| Spinning Disc confocal | Microscope | Quorum Technologies | Quorum Wave FX | Mounted on a Leica DMI6000 Inverted Microscope |
References
- Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M., Atwood, H. L. Synaptic Vesicles: Test for a role in presynaptic Calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
- Macleod, G. T., Hegstro, M., Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast Calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiology. 88, 2659-2663 (2002).
- Morales, M., Ferrus, A., Martinez-Padron, M. Presynaptic calcium-channel currents in normal and csp mutant Drosophila peptidergic terminals. Eur J Neurosci. 11, 1818-1826 (1999).
- Stork, T., Engelen, D., Krudewig, A., Silies, M., Bainton, R. J., Kla¨mbt, C. Organization and Function of the Blood–Brain Barrier in Drosophila. J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).
