Визуализация Живая Drosophila Глиальные-нервно-мышечном соединении с флуоресцентными красителями

Summary

Мы описали особенности строения Глия-нервно-мышечных синапсов в романе наизнанку ткани подготовке живых личинок лету с помощью флуоресцентных красителей с конфокальной микроскопии. Мы живем помечены терминалами нейрона с люминесцентными первичных антител к HRP, а также визуализировать perisynaptic пространство с люминесцентными декстраны.

Abstract

Наш проект определили GFP помечены глиальные структуры на развивающихся личиночных синапсов летать нервно-мышечной. Чтобы посмотреть на развитие живых глиальных-нервно-мышечных синапсов, мы разработали личиночной подготовки ткани, которая была особенностей живой нетронутой личинки, но и имели хорошие оптические свойства. Это новый препарат также позволило для доступа к perfusates синапс. Мы использовали личинки мух, погруженный их в искусственных гемолимфы, и расслабленным их нормальной ритмические сокращения тела путем охлаждения их. Далее мы расчлененный от задних сегментов каждого животного и с тупым контактный насекомых толкнул рот частей назад через полость тела. Это вывернутый личиночной стенкой тела, как поворотный носок наизнанку. Мы завершили вскрытие с ультра-тонкие ножницы вскрытие и таким образом, подвергается висцеральной стороны мышц стенки тела. Глиальных структур на NMJ выразил мембраны целевых GFP под контролем глиальных конкретных промоутеров. Постсинаптической мембраны, ССР (субсинаптической сеточек) в мышечных выразил синаптически целевых DsRed. Нам нужно было остро этикетке двигательный нейрон терминалов, третьей части синапса. Для этого мы обратились первичные антитела к HRP, сопряженных с дальней красной излучающих flurophore. Для проверки свойств красителя диффузии в perisynaptic пространство между двигательный нейрон терминалов и ССР, мы применили решения больших молекул Декстран конъюгированных с дальней красной flurophore излучающих и собрал изображений.

Protocol

Часть 1: Подготовка ткани Наша цель состоит в подготовке ткани личинки мух, где нервная система не повреждена, но внутренняя поверхность мышц стенки тела подвергается воздействию искусственного гемолимфы, и может быть расположен близко к скольжению микроскопа прикрытие для хоро…

Discussion

Эта процедура позволяет долгосрочных изображений живых меченых белков и клеточных процессов. На месте приготовительные ткани мы описали еще нетронутыми и функционирование ЦНС, ПНС и рефлекторных цепей. Эта ткань приготовительные имеет преимущества перед стандартными личиночно…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
HL-6: Artifical Drosophila hemolymph, with 5 mM L-glutamate added, and 2 mM Calcium.	Reagent	NA	NA	5 mM L-glutamate blocked muscle contractions. We used Molecular grade L-Glutamate (Sigma). 2 mM Calcium is close to physiological Calcium levels in natural larval hemolymph. References: Macleod et al 2002 and Macleod 2004
Dextran, Alex Fluor 680; 10,000 MW, anionic, fixable	Reagent	Molecular Probes/Invitrogen	D34680	Use a small volume perfusion chamber to keep the total volume of dye low
Anti-HRP-CY5 conjugate (goat)	Reagent	Jackson ImmunoResearc	123-175-021	Dilute 2.0 mg into 1 ml ddH2O; aliquot into 4 microliter aliquots. Freeze at –20C. Dilute one aliquot into 100 microliters of HL-6
Alexa 647 antibody labeling kit	Reagent	Molecular Probes/Invitrogen	A10475	We prepared a total of 80 micro liters of conjugated primary antibody, and stored as 2 microliter aliquots. We diluted each aliquot into 100 microliter of HL-6 for labeling.
Custom Formulated Objective Oil, refractive index 1.3379	Reagent	Cargill Labs	Custom Formulated
Ultra Fine Forceps	Tool	Fine Science Tolls	11252-23 or 11295-20
Spring scissors	Tool	Fine Science Tools	91500-09
Ultra fine clipper scissors	Tool	Fine Science Tools	15200-00
Perfusion Chamber RC 20 Series	Tool	Warner Instruments	64-02222
Spinning Disc confocal	Microscope	Quorum	Quorum Wave FX	Mounted on a Leica DMI6000 Inverted Microscope