Het visualiseren van de Live- Drosophila Gliale-neuromusculaire Junction met fluorescente kleurstoffen

Summary

We structurele kenmerken van de Glia-neuromusculaire synapsen beschreven in een roman Inside-out het prepareren van weefsels van levende larven gebruik van fluorescerende kleurstoffen met confocale microscopie. We leven zenuwuiteinden gelabeld met fluorescente primaire antilichamen tegen HRP, en ook gevisualiseerd het perisynaptic ruimte met fluorescerende dextranen.

Abstract

Ons project geïdentificeerd GFP-gelabelde gliale structuren op de zich ontwikkelende larven vliegen neuromusculaire synaps. Om te kijken naar de ontwikkeling van levende gliale-zenuw-spier synapsen, ontwikkelden we een schaal voor het prepareren van weefsels die kenmerken van levende larven intact was, maar had ook een goede optische eigenschappen. Deze nieuwe preparaat ook toegestaan ​​voor toegang van perfusates aan de synaps. We gebruikten vliegen larven, ondergedompeld ze in kunstmatige hemolymfe, en hun normale ritmische samentrekkingen lichaam ontspannen door koeling hen. Vervolgens hebben we ontleed uit de achterste segmenten van elk dier en met een stomp insect pin duwde de monddelen achteruit door de lichaamsholte. Dit eversie het larvale lichaam muur, zoals het draaien van een sok binnenstebuiten. We hebben de dissectie met ultra-fijne dissectie schaar en dus blootgesteld de viscerale zijkant van het lichaam muur spieren. De gliale structuren op het NMJ uitgedrukt membraan gericht GFP onder de controle van gliale specifieke promotors. De post-synaptische membraan, de SSR (Subsynaptic Reticula) in de spieren uitgedrukt synaptisch gerichte DsRed. We moesten acuut label van de motor neuron terminals, het derde deel van de synaps. Om dit te doen we primaire antilichamen toegepast op de HRP, geconjugeerd aan een ver-rood emitterende flurophore. Om te testen op kleurstofdiffusie eigenschappen in de perisynaptic ruimte tussen de motor neuron terminals en de SSR, passen we een oplossing van grote Dextraan moleculen geconjugeerd met ver-rood emitterende flurophore en verzamelde beelden.

Protocol

Deel 1: Tissue Voorbereiding

1. Ons doel is een weefsel voorbereiding van de larven, waar het zenuwstelsel intact is, maar de binnenkant van het lichaam muur spier is blootgesteld aan een kunstmatig hemolymfe, en kan dicht bij een microscoop dekglas voor goede optiek worden geplaatst. Met andere woorden, een binnen en van buiten larvale voorbereiding.
   
   Omdat de conventionele weefselpreparaten betrekken snijden, pinning en stretchen van het lichaam muur spieren, en soms het verwijderen van een deel van het zenuwstelsel, moesten we een andere aanpak.
   
   We wilden de dieren inside-out, want we wilden een goede blik op structurele kenmerken en structurele veranderingen in de tijd in de synaps te krijgen, en we wilden houden het zenuwstelsel intact. Wilden we ook voorkomen dat het uitrekken van de weefsels, en het activeren van stretch-receptoren, die zou maken de spieren trillen en ondergang onze beelden.


2. Voor starters, het podium van de dieren. Voeden derde larven en Wandering derde larven zijn groot en makkelijk te ontleden dus we zullen demonstreren op W3 larven. Dit dier is heeft de Tubby fenotype, en is breed, zodat het gemakkelijk is om Evert.
   
   We hebben alleen gebruikt larven die we actief zagen kruipen, waaronder W3 larven.
3. Reinig het oppervlak van een made met een zeer zachte kwast in een petrischaaltje van dubbel gedestilleerd H2O. Schone larven hebben een betere optiek en het schoonmaken reduceert bacteriën.
4. Breng het dier naar een kleine petrischaal van ongeveer 3 ml ijskoud HL-6, en kunstmatige hemolymfe. Zet de schotel op ijs totdat het dier stopt met bewegen, en ontspant (ongeveer 5 minuten).
5. Houd zeer fijne punt tang in de ene hand en in het voorjaar een schaar in de andere. Ik gebruik de schaar met mijn dominante hand. Maak een klein gaatje in het lichaam muur met de schaar om de druk equlibrate over het lichaam muur.
6. Houd het dier met de tang naar beneden op de bodem van de schaal en snijd de achterste twee segmenten. Ontleden weg de ingewanden en het vet het lichaam zal waarschijnlijk verhuizen uit de lichaamsholte. Knip dit weefsel ook.
7. Houd de larven tegen de schotel bodem met fijn pincet. Houd een # 0 insect pin in (met een stompe punt) en duw het tegen de monddelen van de larven. Duw de monddelen door de lichaamsholte alsof je het draaien van een sok binnenste buiten.
8. Binnen naar buiten weefsel eruit komt te zien cijfer: hieronder. Met ultra-fijne ontleden tool, ontleden weg het vet lichaam en trachioles uit het lichaam muur. Probeer ECHT moeilijk om niet aan de trachioles te trekken, of de stekker uit het zenuwstelsel. Het rippen van de trachioles zal scheuren gaten in het lichaam muur spier.
   
   Verwijder zoveel vet lichaam als je kunt. Beide structuren verstoren de optische kwaliteit van uw weefsel. Misschien wilt u de koffie overslaan voordat je dit doet voorbereiding.


9. Wanneer u klaar bent met de spier wordt doorzichtig, niet dekkend of wit. Als je het weefsel in de voorbereiding voor de HL-6 zonder glutamaat, bij kamertemperatuur, zal het waarschijnlijk ritmisch contract, omdat de motor patroon generatoren in het centraal zenuwstelsel werken.
   
   Vermijd het gebruik van preps met duidelijk aangegaan, of onregelmatig gecontracteerd lichaam muur spier.
   
   De intacte binnen en van buiten het lichaam muur snel de neiging op te vouwen in de helft langs de dorsale en ventrale middellijnen, zodat de prep geeft een links of rechts "hemi-dier" te visualiseren.
10. 1.9 Monteer het weefsel in een van beide een klein volume commerciële ruimte, zoals de Warner kamer, of een microscoop dia met een bridged dekglas regeling. Zie deel 3 voor suggesties over montage weefsel.

Deel 2: Neuronale Bouton Labeling met fluorescent gelabelde primaire antilichaam tegen HRP.

1. Zet 50 micro-liter van de fluorescent gelabelde primaire anti-lichaam tegen HRP in HL-6 in een druppel op een petrischaal. Dompel de inside-out lichaam muur prep in het verfbad. U kunt zien neuron terminal etiket na ongeveer 5 minuten, maar incubeer gedurende 10-20 minuten, voor een complete en heldere label.
2. Spoel de kleurstof af voor 10-30 seconden in HL-6 bij kamertemperatuur. Niet-gebonden kleurstof spoelt snel af, zodat de spoeling niet hoeft te worden agressief.
3. Varieer de kleurstof concentratie en de incubatie tijd als nodig is.

Deel 3: Perisynaptic ruimte etikettering met dextran flurophore conjugaat

1. Verdunnen fluorescent geconjugeerd dextran kleurstof verdund in HL-6. Een concentratie die goed werkte voor onze doeleinden was:
2. Als je je geen zorgen over de timing van de kleurstof toegang tot uw extracellulaire ruimte, zet een 20 micro-liter druppel kleurstof op een 'brug' die dekglaasje (zie deel 4) en breng de prep in het verfbad.

Deel 4: Montage van de weefsel voor visualisatie (met confocale microscopie).

Als je niet nodig hebt om uw prep (korte observaties) perfuseren of u wilt het volume van het zwem-HL-6 klein te houden, gebruik dan de dubbele overbrugd slide-methode

Als u wilt uw prep perfuseren, probeer dan met behulp van een perfusie kamer. We gebruikten een modified Kamer van Warner Instruments.

Details voor beide volgen.

Montage prep op een double-overbrugd glijbaan.

1. Gebruik een zeer schone microscoopglaasje. Superlijm twee vierkante, 18mm (# 1.5) dekglaasjes op de dia. Laat een 2 mm afstand tussen de randen van de dekglaasjes.
2. Laat de lijm volledig droog is, of het zal een rare film te vormen over de waterige media rond uw prep.
3. Plaats de binnenste buiten larven tussen de randen van de dekglaasjes. Mogelijk moet u de prep positie op een diagonaal als de larven groot is en uw imago acquisitie systeem heeft een beperkte pixel array.
4. Bedek het weefsel met een # 1.5 dekglaasje, 18mm (zeer schoon). Houden de "top" dekglaasje de glijbaan aangebracht weefsel flankerende glijdt, met een minimum aan vaseline.
5. Doe een druppel Cargill custom objectieve olie met een brekingsindex van 1,3379 (als u de HL-6 te gebruiken) op de bovenste dekglaasje en draai deze vergadering over.
6. Plaats het weefsel montage op uw microscoop-, olie-kant in de richting van het doel, en focus uw doelstelling.
   Montage van het weefsel in een gewijzigde perfusie kamer.
7. Lijm een ​​1,5 dekglaasje om een ​​verdieping in de RC 20 kamer te vormen. Positie van het weefsel in de kamer als per RC-20 instructies. Gebruik een stuk Nytex gaas in plaats van een dekglaasje aan om een ​​dak voor de kamer te vormen.

Deel 5: representatieve resultaten:

1. Inside-out weefsel voorbereiding dissectie volgorde:
   
   W3 larven, gewassen ("Tubby" fenotype) (5.1.1). W3 larven, posterior ontleed twee segmenten. U kunt zien dat dikke lichaam naar buiten geduwd van de lichaamsholte door trans-body muur druk (pijl). Probeer viscerale "uitbarsting" te minimaliseren door het maken van een klein gaatje in het lichaam wand 1 minuut voor dissectie (5.1.2). De voorbereiding met de ingewanden ontleed voordat u de prep binnen naar buiten (5.1.3). De voorbereiding, meestal eversie, met de pin (pijl) in het lumen van de prep (5.1.4). De spier is nu aan de buitenkant en de cuticula is aan de binnenkant, met wat vet lichaam en trachioles bevestigd (5.1.5). Een volledig ontleed weefsel voorbereiding met bijna alle vet lichaam en ontleed trachioles (5.1.6).
   
2. Live-etikettering gebruik van anti-HRP bij de larven NMJ. Een vertegenwoordiger W3 larvale zenuw-spier synaps met een gliale uitbreiding (binnen naar buiten-prep). De motor neuron bouton terminals zijn voorzien van een primaire anti-lichaam tegen HRP (magenta), dat is geconjugeerd aan Cy5. De glia-processen zijn gelabeld met GFP (groen).
   
3. Perisynaptic ruimte fluorescent gevisualiseerd met Alexa 680 dextran in een binnenste buiten prep. De gliale proces (groen) is gelabeld met membraan gerichte GFP. De post-synaptische SSR op de spieren oppervlak (blauw) is gelabeld met DsRed. De Alexa dextran (rood) vormen concentreert zich in de extracellulaire ruimtes. De dextran kleurstof vormen donut vormige zwembaden in de perisynaptic ruimtes. De dextran etikettering en DsRed label SSR worden weergegeven in grijstinten. Let op de verschillende donut gevormde kleurstof zwembaden aandacht voor de perisynaptic ruimtes (pijl).

Discussion

Deze procedure maakt op lange termijn in beeld brengen van live-gelabelde eiwitten en celprocessen. De in situ weefsel prep we beschreven heeft een intact en het functioneren CNS, PNS en reflex circuits. Dit weefsel prep heeft voordelen ten opzichte van standaard larvale vliegen spier-protocollen, waar de larven lichaam muur spier wordt uitgerekt (wanneer het wordt gespeld out). Stretching kan vervormen synaptische morfologie en trigger reflex op basis van de weeën. Onze binnen en van buiten prep was mechanisch stabiel, en was uitzonderlijk goed optiek dat een hoge resolutie analyse van de cellulaire veranderingen gefaciliteerd in real time. Daarnaast heeft de voorbereiding van binnen en van buiten overleefde tot een uur en liet visualisatie van synaptische veranderingen gedurende een lange tijd cursus.

Tijdens de dissectie, zorg om te voorkomen dat schade aan de PNS of CNS. Vermijd ook scheuren of trekken aan de tracheeën, omdat dit schade toe aan de spiercellen. Houd het lichaam muur spier zo ontspannen mogelijk. Koelen van de HL-6 en het weefsel ontspant het lichaam muur spieren en vermindert de trans-body muur spanning. Calcium (2mm) in de in de kunstmatige hemolymfe is essentieel voor de gezondheid en de morfologie van de gliacellen.

Beeldvorming moet worden uitgevoerd op een stabiele, niet-verdragsluitende spierweefsel. Terwijl 5 mM Glutamaat efficiënt blokken neuraal opgeroepen spiercontracties, kan de calciumantagonist Nifedipine wordt een bruikbaar alternatief. Nifedipine op 10 micromolair blokkeert het meeste (maar niet alle) zenuw opgeroepen spiercontractie. Nifedipine blokken spanningsgevoelige calciumkanalen op de spier celmembraan effectiever dan kanalen verbonden met neurotransmitter release, waardoor het blokkeren van samentrekken van de spieren met de mogelijkheid van een normale NMJ synaptische functie (Morrales et al. 1999).

Met behulp van het antilichaam labeling procedure, we robuust bestempeld als de extracellulaire koolhydraat residuen uitgedrukt op zenuwuiteinden, die worden erkend door de anti-HRP primaire antilichaam. We kregen uitstekende etiket het gebruik van de anti-HRP antilichaam van Jackson Labs, beschikbaar pre-geconjugeerd aan een verscheidenheid van fluoroforen (Cy5-in onze studies). Deze benadering kan worden aangepast voor gebruik met een primair antilichaam dat een epitoop herkent extracellulaire, bijvoorbeeld etikettering extracellulaire matrix moleculen.

De in situ "inside-out" weefsel voorbereiding, in combinatie met een wijziging van het protocol dat wordt gebruikt door Stork et al. 2008, is nuttig voor het sonderen van cellulaire diffusie barrières. Fluorescerende dextran kleurstofdiffusie kan ook nuttig zijn voor de timing en visualiseren van perfusievloeistof en drugs toegang tot inter-cellulaire ruimtes, zoals de synaptische spleten.

Met fluorescerende kleurstoffen dextran, is het essentieel om een ​​klein volume perfusie ruimte gebruiken. Als er te "dik" een grenslaag van kleurstof oplossing met betrekking tot de structuur die je zoekt om de afbeelding, kan de kleurstof oplossing obscure de functie van belang, vanwege het gebrek aan contrast tussen de kleurstof toegediend ruimten en de omliggende structuren.

Tot slot, onze structurele labeling technieken vereisen een hoge resolutie imaging systeem geschikt voor levend weefsel. We gebruikten draaiende schijf confocale microscopen (Quorum technologieën en Perkin-Elmer-systemen) in combinatie met Volocity software (improvisatie), een lange lengte, een hoge numerieke apertuur 63x onderdompeling in water lens, en lasers en filters geschikt voor het visualiseren van GFP, DsRed en veel rood fluoroforen. Voor beeldvorming gebruikten we op maat geformuleerd microscoop objectieve olie van Cargill laboratoria aan de brekingsindex van de kunstmatige hemolymfe, HL-6, in combinatie met de 63x water onderdompeling lens wedstrijd. Zonder deze olie, brekingsfout was significant en resulteerde in vervormde beelden. Onze in-situ voorbereiding kan worden gebruikt met andere 3-D imaging systemen, zoals de API DeltaVision Scanning Restauratie systeem. Wel moet erop worden gelet dat de hoge niveaus van lichtverstrooiing te overwinnen van de dikke, levend weefsel voorbereiding.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
HL-6: Artifical Drosophila hemolymph, with 5 mM L-glutamate added, and 2 mM Calcium.	Reagent	N/A	NA	5 mM L-glutamate blocked muscle contractions. We used Molecular grade L-Glutamate (Sigma).2 mM Calcium is close to physiological Calcium levels in natural larval hemolymph.References: Macleod et al 2002 and Macleod 2004
Dextran, Alex Fluor 680; 10,000 MW, anionic, fixable	Reagent	Molecular Probes, Life Technologies	D34680	Use a small volume perfusion chamber to keep the total volume of dye low
Anti-HRP-CY5 conjugate (goat)	Reagent	Jackson ImmunoResearch	123-175-021	Dilute 2.0 mg into 1 ml ddH2O; aliquot into 4 microliter aliquots. Freeze at –20C. Dilute one aliquot into 100 microliters of HL-6
Alexa 647 antibody labeling kit	Reagent	Molecular Probes, Life Technologies	A10475	We prepared a total of 80 micro liters of conjugated primary antibody, and stored as 2 microliter aliquots. We diluted each aliquot into 100 microliter of HL-6 for labeling.
Custom Formulated Objective Oil, refractive index 1.3379	Reagent	Cargill Labs	Custom Formulated
Ultra Fine Forceps	Tool	Fine Science Tools	11252-23 or 11295-20
Spring scissors	Tool	Fine Science Tools	91500-09
Ultra fine clipper scissors	Tool	Fine Science Tools	15200-00
Perfusion Chamber RC 20 Series	Tool	Warner Instruments	64-02222
Spinning Disc confocal	Microscope	Quorum Technologies	Quorum Wave FX	Mounted on a Leica DMI6000 Inverted Microscope