Summary

Visualizando o Live Drosophila Junção neuromuscular-Glial com corantes fluorescentes

Published: May 13, 2009
doi:

Summary

Descrevemos as características estruturais das sinapses Glia-neuromuscular em um romance de preparação dos tecidos dentro para fora-de larvas de moscas ao vivo usando corantes fluorescentes com microscopia confocal. Nós rotulados terminais de neurônios fluorescentes viver com anticorpos primários para HRP, e também visualizar o espaço perisynaptic com Dextranos fluorescente.

Abstract

Nosso projeto identificou GFP rotulados estruturas glial no desenvolvimento larval sinapse neuromuscular voar. Olhar para o desenvolvimento de viver glial-nervo-músculo sinapses, desenvolvemos uma preparação do tecido larval que tinham características de larvas intactas ao vivo, mas também teve boas propriedades ópticas. Esta nova preparação também permitiu o acesso de perfusato para a sinapse. Usamos larvas de moscas, imersa-los em hemolinfa artificial, e relaxaram seus normais contrações rítmicas do corpo de arrefecimento-los. Em seguida, dissecados fora os segmentos posterior de cada animal e com um alfinete de inseto blunt empurrou a partes da boca para trás através da cavidade do corpo. Este evertido da parede do corpo larval, como transformar uma meia dentro para fora. Concluímos a dissecção com tesoura ultra-fina dissecação e, portanto, expostos ao lado visceral dos músculos da parede do corpo. As estruturas glial no MNJ expressa GFP membrana alvo sob o controle de promotores glial específico. A membrana pós-sináptica, a SSR (Reticula subsináptico) no músculo expressa sinapticamente alvo dsRed. Precisávamos aguda rótulo os terminais do neurônio motor, a terceira parte da sinapse. Para fazer isso, aplicamos anticorpos primários para HRP, conjugado a um flurophore emitindo far-vermelho. Para testar as propriedades de difusão de corante no espaço perisynaptic entre os terminais do neurônio motor e da SSR, aplicou-se uma solução de moléculas grandes Dextran conjugado com muito vermelho flurophore emissora e imagens recolhidas.

Protocol

Parte 1: Preparação do tecido Nosso objetivo é uma preparação de tecidos de larvas de moscas, onde o sistema nervoso está intacta, mas a superfície interior do músculo parede do corpo é exposto a uma hemolinfa artificial, e pode ser posicionada perto de uma lamínula de microscópio de ótica bom. Em outras palavras, uma de dentro para fora preparação larval. Desde preparações de tecido convencional envolvem corte, prendendo e alongamento do músculo parede do corpo e, por vezes reti…

Discussion

Este procedimento permite a longo prazo de imagens ao vivo de proteínas etiquetadas e processos celulares. O tecido em prep situ descrevemos tem um SNC intacto e em funcionamento, PNS e circuitos reflexos. Esta preparação do tecido tem vantagens sobre protocolos padrão voar larval muscular, onde o músculo da parede do corpo larval é esticada (quando ele é preso para fora). Alongamento pode distorcer a morfologia sináptica e desencadear reflexo contrações based. Nossa preparação foi dentro p…

Acknowledgements

Este projeto foi financiado pelo CIHR e NSERC. Gostaríamos de agradecer Jusiak Barb para contribuir para a criação das cepas voar expressar dsRed SSR marcados (linha BJ), eo UBC Facility Bio-imagem.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
HL-6: Artifical Drosophila hemolymph, with 5 mM L-glutamate added, and 2 mM Calcium. Reagent NA NA 5 mM L-glutamate blocked muscle contractions. We used Molecular grade L-Glutamate (Sigma). 2 mM Calcium is close to physiological Calcium levels in natural larval hemolymph. References: Macleod et al 2002 and Macleod 2004
Dextran, Alex Fluor 680; 10,000 MW, anionic, fixable Reagent Molecular Probes/Invitrogen D34680 Use a small volume perfusion chamber to keep the total volume of dye low
Anti-HRP-CY5 conjugate (goat) Reagent Jackson ImmunoResearc 123-175-021 Dilute 2.0 mg into 1 ml ddH2O; aliquot into 4 microliter aliquots. Freeze at –20C. Dilute one aliquot into 100 microliters of HL-6
Alexa 647 antibody labeling kit Reagent Molecular Probes/Invitrogen A10475 We prepared a total of 80 micro liters of conjugated primary antibody, and stored as 2 microliter aliquots. We diluted each aliquot into 100 microliter of HL-6 for labeling.
Custom Formulated Objective Oil, refractive index 1.3379 Reagent Cargill Labs Custom Formulated  
Ultra Fine Forceps Tool Fine Science Tolls 11252-23 or 11295-20  
Spring scissors Tool Fine Science Tools 91500-09  
Ultra fine clipper scissors Tool Fine Science Tools 15200-00  
Perfusion Chamber RC 20 Series Tool Warner Instruments 64-02222  
Spinning Disc confocal Microscope Quorum Quorum Wave FX Mounted on a Leica DMI6000 Inverted Microscope

References

  1. Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M., Atwood, H. L. Synaptic Vesicles: Test for a role in presynaptic Calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
  2. Macleod, G. T., Hegstro, M., Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast Calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiology. 88, 2659-2663 (2002).
  3. Morales, M., Ferrus, A., Martinez-Padron, M. Presynaptic calcium-channel currents in normal and csp mutant Drosophila peptidergic terminals. Eur J Neurosci. 11, 1818-1826 (1999).
  4. Stork, T., Engelen, D., Krudewig, A., Silies, M., Bainton, R. J., Kla¨mbt, C. Organization and Function of the Blood–Brain Barrier in Drosophila. J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).

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Cite This Article
Brink, D., Gilbert, M., Auld, V. Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (27), e1154, doi:10.3791/1154 (2009).

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