Descrevemos as características estruturais das sinapses Glia-neuromuscular em um romance de preparação dos tecidos dentro para fora-de larvas de moscas ao vivo usando corantes fluorescentes com microscopia confocal. Nós rotulados terminais de neurônios fluorescentes viver com anticorpos primários para HRP, e também visualizar o espaço perisynaptic com Dextranos fluorescente.
Nosso projeto identificou GFP rotulados estruturas glial no desenvolvimento larval sinapse neuromuscular voar. Olhar para o desenvolvimento de viver glial-nervo-músculo sinapses, desenvolvemos uma preparação do tecido larval que tinham características de larvas intactas ao vivo, mas também teve boas propriedades ópticas. Esta nova preparação também permitiu o acesso de perfusato para a sinapse. Usamos larvas de moscas, imersa-los em hemolinfa artificial, e relaxaram seus normais contrações rítmicas do corpo de arrefecimento-los. Em seguida, dissecados fora os segmentos posterior de cada animal e com um alfinete de inseto blunt empurrou a partes da boca para trás através da cavidade do corpo. Este evertido da parede do corpo larval, como transformar uma meia dentro para fora. Concluímos a dissecção com tesoura ultra-fina dissecação e, portanto, expostos ao lado visceral dos músculos da parede do corpo. As estruturas glial no MNJ expressa GFP membrana alvo sob o controle de promotores glial específico. A membrana pós-sináptica, a SSR (Reticula subsináptico) no músculo expressa sinapticamente alvo dsRed. Precisávamos aguda rótulo os terminais do neurônio motor, a terceira parte da sinapse. Para fazer isso, aplicamos anticorpos primários para HRP, conjugado a um flurophore emitindo far-vermelho. Para testar as propriedades de difusão de corante no espaço perisynaptic entre os terminais do neurônio motor e da SSR, aplicou-se uma solução de moléculas grandes Dextran conjugado com muito vermelho flurophore emissora e imagens recolhidas.
Este procedimento permite a longo prazo de imagens ao vivo de proteínas etiquetadas e processos celulares. O tecido em prep situ descrevemos tem um SNC intacto e em funcionamento, PNS e circuitos reflexos. Esta preparação do tecido tem vantagens sobre protocolos padrão voar larval muscular, onde o músculo da parede do corpo larval é esticada (quando ele é preso para fora). Alongamento pode distorcer a morfologia sináptica e desencadear reflexo contrações based. Nossa preparação foi dentro p…
Este projeto foi financiado pelo CIHR e NSERC. Gostaríamos de agradecer Jusiak Barb para contribuir para a criação das cepas voar expressar dsRed SSR marcados (linha BJ), eo UBC Facility Bio-imagem.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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HL-6: Artifical Drosophila hemolymph, with 5 mM L-glutamate added, and 2 mM Calcium. | Reagent | NA | NA | 5 mM L-glutamate blocked muscle contractions. We used Molecular grade L-Glutamate (Sigma). 2 mM Calcium is close to physiological Calcium levels in natural larval hemolymph. References: Macleod et al 2002 and Macleod 2004 |
Dextran, Alex Fluor 680; 10,000 MW, anionic, fixable | Reagent | Molecular Probes/Invitrogen | D34680 | Use a small volume perfusion chamber to keep the total volume of dye low |
Anti-HRP-CY5 conjugate (goat) | Reagent | Jackson ImmunoResearc | 123-175-021 | Dilute 2.0 mg into 1 ml ddH2O; aliquot into 4 microliter aliquots. Freeze at –20C. Dilute one aliquot into 100 microliters of HL-6 |
Alexa 647 antibody labeling kit | Reagent | Molecular Probes/Invitrogen | A10475 | We prepared a total of 80 micro liters of conjugated primary antibody, and stored as 2 microliter aliquots. We diluted each aliquot into 100 microliter of HL-6 for labeling. |
Custom Formulated Objective Oil, refractive index 1.3379 | Reagent | Cargill Labs | Custom Formulated | |
Ultra Fine Forceps | Tool | Fine Science Tolls | 11252-23 or 11295-20 | |
Spring scissors | Tool | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Ultra fine clipper scissors | Tool | Fine Science Tools | 15200-00 | |
Perfusion Chamber RC 20 Series | Tool | Warner Instruments | 64-02222 | |
Spinning Disc confocal | Microscope | Quorum | Quorum Wave FX | Mounted on a Leica DMI6000 Inverted Microscope |