Visualiser le Live Drosophile Gliales-jonction neuromusculaire avec des colorants fluorescents
Summary
Nous avons décrit les caractéristiques structurelles des synapses neuromusculaires Glia-dans un roman de préparation des tissus intérieur-extérieur de larves de mouches en direct en utilisant des colorants fluorescents en microscopie confocale. Nous avons étiqueté terminaisons neuronales vivre avec fluorescentes anticorps primaires à HRP, et également visualisé l'espace perisynaptic avec dextranes fluorescents.
Abstract
Notre projet a identifié GFP étiqueté structures gliales à la volée des larves synapse neuromusculaire développement. Pour regarder le développement de vivre gliales-nerf-muscle synapses, nous avons développé une préparation des tissus larvaires qui avait les caractéristiques des larves intactes vivre, mais a également eu de bonnes propriétés optiques. Cette nouvelle préparation a également permis l'accès des perfusates vers la synapse. Nous avons utilisé des larves de mouches, les immergé dans l'hémolymphe artificielle, et assoupli leurs contractions normales du corps rythmés par les paralysant. Ensuite, nous disséqué les segments postérieurs de chaque animal et des insectes avec une épingle émoussée poussé les parties de la bouche vers l'arrière dans la cavité du corps. Cette éversée la paroi du corps larvaire, comme tourner une chaussette à l'envers. Nous avons terminé la dissection aux ciseaux de dissection ultra-fines et donc exposé le côté viscéral du muscles de la paroi du corps. Les structures gliales à la JNM exprimé la GFP membrane cible sous le contrôle de promoteurs spécifiques gliales. La membrane post-synaptique, la SSR (Reticula Subsynaptic) dans le muscle ciblé exprimé synaptiquement DsRed. Nous avions besoin d'acuité l'étiquette des bornes du neurone moteur, la troisième partie de la synapse. Pour ce faire, nous avons appliqué aux anticorps primaires HRP, conjugué à un flurophore émettant rouge lointain. Pour tester les propriétés de diffusion du colorant dans l'espace perisynaptic entre les bornes du neurone moteur et la SSR, nous avons appliqué une solution de molécules de dextran conjugué à grande flurophore émettant rouge lointain et les images collectées.
Protocol
Discussion
Cette procédure permet à long terme d'imagerie de vivre protéines marquées et les processus cellulaires. La préparation de tissu in situ, nous avons décrit est une SNC intacte et son fonctionnement, PNS et circuits réflexes. Cette préparation de tissus a des avantages sur la norme des larves protocoles musculaire volée, où le muscle du corps larvaire mur est tendu (quand il est tombé sur). Les étirements peuvent fausser la morphologie synaptique et de déclencher des contractions réfle…
Acknowledgements
Ce projet a été financé par les IRSC et le CRSNG. Nous tenons à remercier Jusiak Barb pour contribuer à la création de souches exprimant volée DsRed étiquetés SSR (ligne BJ), et la UBC de bio-imagerie facilité.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| HL-6: Artifical Drosophila hemolymph, with 5 mM L-glutamate added, and 2 mM Calcium. | Reagent | NA | NA | 5 mM L-glutamate blocked muscle contractions. We used Molecular grade L-Glutamate (Sigma). 2 mM Calcium is close to physiological Calcium levels in natural larval hemolymph. References: Macleod et al 2002 and Macleod 2004 |
| Dextran, Alex Fluor 680; 10,000 MW, anionic, fixable | Reagent | Molecular Probes/Invitrogen | D34680 | Use a small volume perfusion chamber to keep the total volume of dye low |
| Anti-HRP-CY5 conjugate (goat) | Reagent | Jackson ImmunoResearc | 123-175-021 | Dilute 2.0 mg into 1 ml ddH2O; aliquot into 4 microliter aliquots. Freeze at –20C. Dilute one aliquot into 100 microliters of HL-6 |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Reagent | Molecular Probes/Invitrogen | A10475 | We prepared a total of 80 micro liters of conjugated primary antibody, and stored as 2 microliter aliquots. We diluted each aliquot into 100 microliter of HL-6 for labeling. |
| Custom Formulated Objective Oil, refractive index 1.3379 | Reagent | Cargill Labs | Custom Formulated | |
| Ultra Fine Forceps | Tool | Fine Science Tolls | 11252-23 or 11295-20 | |
| Spring scissors | Tool | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Ultra fine clipper scissors | Tool | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Perfusion Chamber RC 20 Series | Tool | Warner Instruments | 64-02222 | |
| Spinning Disc confocal | Microscope | Quorum | Quorum Wave FX | Mounted on a Leica DMI6000 Inverted Microscope |
References
- Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M., Atwood, H. L. Synaptic Vesicles: Test for a role in presynaptic Calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
- Macleod, G. T., Hegstro, M., Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast Calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiology. 88, 2659-2663 (2002).
- Morales, M., Ferrus, A., Martinez-Padron, M. Presynaptic calcium-channel currents in normal and csp mutant Drosophila peptidergic terminals. Eur J Neurosci. 11, 1818-1826 (1999).
- Stork, T., Engelen, D., Krudewig, A., Silies, M., Bainton, R. J., Kla¨mbt, C. Organization and Function of the Blood–Brain Barrier in Drosophila. J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).
