Summary
نحن هنا وصف بروتوكول لدراسة الهجرة من الخلايا الدبقية في عين ذبابة الفاكهة النامية باستخدام التحليل المجهري مع الخلايا الحية المقترنة GFP الدبقية المفتاحية.
Abstract
يجب أن الخلايا الدبقية كل من الفقاريات واللافقاريات الكائنات على الهجرة الى مناطق الهدف النهائي من أجل ensheath ودعم الخلايا العصبية المرتبطة بها. بينما أحرز التقدم الذي أحرز مؤخرا لوصف الهجرة حية من خلايا الدبقية في الجناح العذراء النامية (1) ، ودراسات
Protocol
الجزء 1 : قبل انشاء التجريبية.
- أسبوع واحد في وقت مبكر ، لم الذباب لتوليد اليرقة التي تعبر عن GFP تحت سيطرة أحد المروجين الدبقية محددة. لتجربتنا نحن تصور GFP المفتاحية مع تسلسل توطين النووية التي أعرب عنها في الخلايا الدبقية باستخدام عكس القطبية (الريبو) المروج (3 ، 4).
- إعداد قسائم تغطية ما لا يقل عن يوم واحد في وقت مبكر عن طريق نقع 18 ملم زلات تغطية الجولة لمدة 10 دقيقة في 1 ٪ بولي - L - حل ليسين والهواء الجاف بين عشية وضحاها.
- في اليوم قبل التجربة ، وتنظيف الغرفة Chamlide ثقافة مكونات المغناطيسي عن طريق نقع بين عشية وضحاها في الايثانول 70 ٪.
- في يوم من التجربة ، وإعداد مستنبت بإضافة مصل بقري جنيني ، والحل البنسلين الستربتوميسين ، والانسولين الى 10 مل من المتوسط شنايدر باستخدام تقنية الحشرة العقيم. تركيزات العمل هي : 1X مصل بقري جنيني ؛ 100U/ml البنسلين ؛ الستربتوميسين 0.1mg/ml ؛ و 0.2 ملغ / مل الانسولين في المتوسط شنايدر الحشرات (معدلة من (5)).
- السماح للغرفة الثقافة في الهواء الجاف في زنزانة هود الثقافة. يغسل الايثانول المتبقية من الغرفة الثقافة عن طريق الشطف مع مستنبت المعدة.
الجزء 2 : تشريح للمجمع العين والدماغ ذبابة الفاكهة.
- حدد اليرقة الثالثة طور مرحلي تجول من جانب قنينة يطير وضعها في قطرة من مستنبت المبردة على طبق بتري على الجليد لعدة دقائق. تقشعر لها الأبدان اليرقة ينصح لإبطاء تقلصات الجسم تحوي لسهولة تشريح.
- مكان اليرقة المبردة في قطرة من مستنبت على طبق المغلفة Sylgard تشريح تحت المجهر.
- تشريح تحت المجهر ، واستخدام زوج من ملقط دومون غرامة لنتشبث اليرقة حوالي ثلث الطريق من النهاية الخلفية. انتظر حتى يقذف خطاطيف اليرقة فمه من نهاية الأمامي. فهم الفم السنانير مع الزوج الثاني من ملقط على امتداد كامل. تشريح اليرقة ، وسحب ببطء أزواج اثنين من الملقط في اتجاهين متعاكسين. مجمع العين والدماغ ، جنبا إلى جنب مع الغدد اللعابية ، والهيئات الدهون ، والأنسجة تخيلي ، وسوف تسحب بعيدا عن الجسم اليرقات. لا سحب السنانير الفم جدا إلا أنها سرعان ما سوف المسيل للدموع قبالة مجمع العين والدماغ.
- تقليم بعيدا الغدد اللعابية ، والهيئات الدهون ، وأقراص تخيلي باستخدام مقص المقص غاية في الدقة. وسيتم إرفاق نصفي الدماغ والعين إلى أقراص الحبل البطني العصب والسنانير الفم.
- مكان غطاء 18 مم زلة على شريحة زجاجية. ترك حافة واحدة من زلة تغطية تتدلى على حافة الشريحة من أجل التقاط ما يصل في وقت لاحق لتغطية زلة. إضافة قطرة من مستنبت على قسيمة 18 مم غطاء. نقل مجمع العين والدماغ المتوسط في الثقافة عن طريق استيعاب السنانير الفم بالملقط. لا فهم مجمع العين والدماغ مباشرة مع ملقط أو سوف تلف الأنسجة.
- باستخدام مقص تشريح غرامة ، وتقليم قبالة مصب السنانير من مجمع العين والدماغ وتجاهل. إزالة السنانير الفم المهم للتصوير العيش كما السنانير الفم ستواصل عقد في المتوسط مما تسبب في نسيج الثقافة للتحرك خلال الفحص المجهري.
- تصور الهجرة الدبقية داخل القرص تخيلي العين ، وقطع بعناية ساق البصرية ، والأنسجة الرقيقة التي تربط الدماغ والعين القرص ودفع بعيدا أو تجاهل الدماغ (انظر الشكل 1A). لتصور الدبقية داخل ساق البصرية ، ويترك الدماغ ، وساق البصرية ، وقرص تخيلي العين سليمة (انظر الشكل 1E).
- التقط ساترة باستخدام ملقط ورسم دائرة حول الأنسجة تحت المصالح مع علامة دائمة. هذه الحلقة سوف تساعد في تحديد مكان وجود الأنسجة للفحص المجهري في الجزء 4.
الجزء 3 : تركيب القرص العين تخيلي في غرفة الثقافة المغناطيسي.
- باستخدام الملقط ، فهم على حافة اعدام ساترة. نقل إلى لوحة ساترة السفلي من الغرفة المغناطيسي Chamlide دون الإخلال في نسيج الثقافة.
- وضع السيليكون يا الدائري على الجسم الرئيسي للغرفة Chamlide. تثبيت الجسم الرئيسي في أعلى لوحة أسفل.
- إضافة مستنبت ببطء الى قاعة المحكمة. لا إضافة مستنبت بسرعة كبيرة جدا أو سيتم بالانزعاج الأنسجة من الاهتمام. لا تملأ تماما الغرفة للسماح لتبادل الغاز تحت الغطاء.
- المكان برفق غطاء غير مرئي في أعلى الغرفة Chamlide.
الجزء 4 : التصور ترحيل الخلايا الدبقية في القرص العين.
- المكان قاعة الثقافة في مرحلة المجهر مبائر أو مضان. تحديد موقع العينة باستخدام الدائرة على ساترة كمرجع على التكبير منخفضة.
- التركيز على عينة باستخدام عدسة 40X. تسمح الأنسجة لتترسب على ساترة. التقاط الصور من القرص البصري للعين أو ساق في كل 10 ساعة على مدى 15min 3-4. قد الأنسجة نشل والانتقال من التركيز. وسوف تركز النسيج يدويا قبل التقاط الصورة تخفيف الهو المشكلة.
الجزء 5 : نتائج الممثل :
بروتوكول يسمح لنا القيام بشكل صحيح ، نحن لجمع سلسلة من الصور من GFP الموسومة الخلايا الدبقية التي هاجرت من السويقة البصرية في العين تخيلي القرص (الشكل 1 دينار بحريني). بينما يعيش التصوير لمدة 60 دقيقة كانت كافية لمراقبة التغيرات في مواقف نوى الدبقية داخل قرص نوع العين البرية تخيلي ، نوى الدبقية في متحولة عن الجينات اللازمة لخلايا الدبقية الهجرة فشلت تماما للخروج من السويقة البصرية (السهام الشكل 1 FH).
لدينا مثقف العين والدماغ مجمعات لفترات ما دام 240 دقيقة قبل رصد تدهور الأنسجة المستزرعة. بعد نقطة من الوقت 240 دقيقة نبدأ لمراقبة الخلايا GFP إيجابية في الأجلين المتوسط الثقافة المحيطة مثقف العين والدماغ مجمعات (السهم الشكل 2 C). بالإضافة إلى ذلك سيتم في GFP تتراكم في البقع المنتشرة في جميع أنحاء الأنسجة مما يشير إلى انهيار سلامة الأنسجة.
الشكل 1 : تصوير مباشر من GFP الموسومة نوى الدبقية في نوع البرية النامية والنظم البصرية متحولة.
A ، E) الصور التي يتم التقاطها باستخدام الفرق المقابل تدخل (DIC) المجهري البرية من نوع المثقف ومتحولة العين تخيلي أقراص (ED). في نوع البرية ، ولدت في الخلايا الدبقية وترحيل من ساق البصرية (OS) في قرص العين. تمت إزالة المخ لتسهيل التسوية والتصوير من القرص العين تخيلي. دينار بحريني) المجهري الإسفار من القرص نوع العين مثقف البرية تخيلي في الفقرة (أ) عند 0 يكشف عن 30 ، و 60 نقطة الوقت دقيقة ، GFP الموسومة نوى الدبقية ترحيل داخل القرص العين.
FH) المجهري الإسفار لمجمع العين والدماغ في متحولة (E) في 0 ، 30 ، 60 نقطة والوقت دقيقة يدل على توقف GFP الموسومة نوى الدبقية داخل السويقة البصرية (السهم). وقد تركت الدماغ (BR) تعلق على ساق البصرية لتسهيل تصوير الدبقية داخل ساق.
الشكل 2 : تصوير مباشر من GFP الموسومة الأغشية الدبقية في قرص نوع العين البرية تخيلي. لقد نجحنا في تربيتها العين والدماغ مجمعات لمدة 240 دقيقة الفترات. الأنسجة مثقف أطول من 240 دقيقة تبدأ لكسر. المتوسط الثقافة المحيطة القرص العين تخيلي (ED) ، السويقة البصرية (OS) ، والفص الدماغ (BR) عند 0 (أ) و 150 دقيقة (B) ، مقارنة ب 300 مرة في الدقيقة نقطة (C) ، هي حرة من GFP إيجابية الخلايا المشار إليها بواسطة سهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول وصفنا مراقبة الهجرة الخلايا الدبقية إلى القرص العين تخيلي باستخدام المجهر العيش. في مثالنا اكتب البرية (الشكل 1 م) ، استخدمنا علامة GFP النووية لمراقبة حركة الخلايا الدبقية في القرص العين على مدى ساعة واحدة. في متحولة عن الجينات المطلوبة للمرشح للهجرة الخلايا الدبقية حاليا قيد الدراسة في المختبرات لدينا ، احظنا توقف نوى الخلايا الدبقية داخل السويقة البصرية خلال فترة ساعة واحدة (الشكل 1 EH). ويمكن تكييف استراتيجيتنا لتصور مزيدا من التفاصيل السلوك الخلوية التي ينظمها الجينات لدينا الفائدة. على سبيل المثال ، الغشاء استهدفت جزيء GFP ، مثل GFP - mCD8 ، يمكن التعبير عنها في الدبقية لتصور العمليات الخلوية. استخدام علامة غشاء GFP ملزمة ستتيح لنا تحديد ما إذا كانت الخلايا الدبقية في المسوخ لدينا هي قادرة على توسيع نطاق العمليات الخلوية مثل أرجل كاذبة خيطية إلى القرص العين. وبالمثل يمكن أن يتم التعبير عن أكتين الموسومة ب GFP أو تويولين الموسومة ب GFP في الدبقية النامية لتصور التغيرات في الهيكل الخلوي أثناء الهجرة الخلايا الدبقية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن فحص الخلايا الطافرة واحد GFP المسمى الدبقية تصور باستخدام المجهر العيش (6). وهذه التقنية تسمح لنا على نحو أكثر دقة وصف شرط الجينات لدينا مصلحة في تنظيم الهجرة من الخلايا الدبقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
معتمد من قبل باتريك كافرتى زمالات ما بعد الدكتوراه من جمعية التصلب المتعدد في كندا.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine | Reagent | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Schneider’s Insect Media | Reagent | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Penicillin-Streptomycin | Reagent | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Insulin solution from bovine pancreas | Reagent | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Chamlide Magnetic chamber | Tool | Live cell Instrument | CM-R-10 | 35 mm dish type chamber for 18 mm coverslip |
| Ultra fine clipper scissors | Tool | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Dumont #5 forceps | Tool | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fluorescent microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Any fluorescent imaging system that has the necessary filters and excitation for GFP can be used. |
References
- Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. Glial chain migration requires pioneer cells. J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).
- Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. Glial cell migration in the eye disc. J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Sepp, K. J., Auld, V. J. Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster. Genetics. 151, 1093-1101 (1999).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
