Summary
Burada, glial hücreler göç GFP etiketli glial hücreler ile eşleştirilmiş canlı mikroskobik analizi ile gelişmekte olan Drosophila göz içine incelemek için bir protokol açıklar.
Abstract
Omurgalı ve omurgasız organizmaların hem de glial hücreleri ensheath için nihai hedef bölgelere göç ve ilişkili nöronlar desteği gerekir. Son ilerleme gelişmekte olan pupa kanat (1), çalışmaları glial hücreler canlı göç tanımlamak için yapılmış olsa da
Protocol
Bölüm 1: Ön-deneysel set-up.
- Bir hafta önceden arkadaşı larva oluşturmak için uçar ifade GFP kontrolü altında özel bir glial organizatörü. Deneme için bir nükleer yerelleştirme sırası ile ters polarite (repo) organizatörü (3, 4) glial hücreleri kullanarak ifade etiketli GFP görüntülendi.
- % 1 gecede kuru poli-L-lisin çözüm ve hava 10 dakika boyunca 18 mm yuvarlak kapak fişleri iliklerine tarafından en az bir gün önceden fişleri kapak hazırla.
- Deney bir gün önce, bir gecede% 70 etanol bileşenleri iliklerine Chamlide manyetik kültür odası temiz.
- Deney günü, Schneider böcek orta aseptik teknik kullanılarak 10 ml fetal sığır serumu, penisilin-streptomisin çözüm, ve insülin ekleyerek kültür ortamı hazırlamak. Çalışma konsantrasyonları: 1X fetal sığır serum; 100U/ml penisilin, 0.1mg/ml streptomisin ve 0.2 mg / ml Schneider böcek ortamda insülin (değiştirilmiş (5)).
- Kültür odasının bir hücre kültürü kaputu kurumaya bırakın. Hazırlanan kültür ortamı ile durulama kültür odası artık etanol yıkayınız.
Bölüm 2: Drosophila göz-beyin kompleks Diseksiyon.
- Birkaç dakika süreyle buz üzerinde soğutulmuş kültür ortamı bir petri açılan bir sinek şişe ve yerin yan tarafında bir üçüncü instar dolaşıp larva seçin. Larva Chilling diseksiyon kolaylığı için peristaltik vücut kasılmaları yavaş tavsiye edilir.
- Diseksiyon mikroskop altında Sylgard kaplı çanak kültür ortamı bir damla soğuk larva yerleştirin.
- Diseksiyon mikroskobu altında, larva arka ucundan yolu yaklaşık üçte birini sıkıca kavramak için Dumont ince forseps bir çift kullanın. Larva ön sonundan itibaren ağzında kanca extrudes kadar bekleyin. Ağız tam uzantısı üzerine ikinci bir çift forseps ile kanca kavrayın. Larva incelemek için, forseps, iki çift zıt yönlerde yavaşça çekin. Göz-beyin kompleksi, tükürük bezleri, yağ organları, ve hayali doku ile birlikte, larva vücuttan uzakta çeker. Ağız, göz-beyin kompleks yırttınız hızla aksi takdirde çok kanca çekmeyin.
- Tükürük bezleri, yağ organları, ve ultra-ince clipper makas kullanılarak hayali diskler uzak kesin. Beyin ve göz-diskler iki yarımküresinin ventral sinir kablosu ve ağız çengelleri eklenecektir.
- 18 mm kapak kayma bir cam slayt üzerine yerleştirin. Sonra kapak kayma pick up için slayt kenarına asılı kapak kayma bir kenar bırakın. 18 mm kapak kayma kültür ortamı üzerine bir damla ekleyin. Forseps ile ağız kanca tutarak, kültür ortamı içine göz-beyin kompleksi aktarın. Forseps veya doku hasar ile doğrudan göz-beyin kompleksi kavramak etmeyin.
- Ince diseksiyon makas kullanmak, ağız, göz-beyin kompleksi ve atın kanca keserek. Ağız kancaları, doku mikroskopi sırasında taşımak için neden kültür ortamı sözleşme devam edecek gibi ağız kanca kaldırılması canlı görüntüleme için önemlidir.
- Göz hayali disk içinde glial göç görselleştirmek için, dikkatlice kesilmiş ve optik sapı, beyin ve göz disk bağlayan ince bir doku (Şekil 1A) beyin uzağa itmek ya da atın. Optik sapı içindeki glia görselleştirmek için, beyin, optik sapı ve sağlam göz hayali disk (Şekil 1E) bırakın.
- Forseps kullanarak lamel Pick up ve kalıcı bir kalem ile ilgi doku etrafında altında bir daire çizin. Bu daire Bölüm 4 mikroskobu için doku yerini yardımcı olacaktır.
Bölüm 3: Manyetik bir kültür odasında göz hayali disk montajı.
- Forseps kullanarak, lamel asma kenarında kavrayın. Doku kültürü bozmadan Chamlide manyetik odasının alt plaka lamel aktarın.
- Chamlide odasının ana gövde üzerine silikon O-ring yerleştirin. Alt plakası ana gövde üstüne yükleyin.
- Odaya kültür ortamı yavaş yavaş ekleyin. Kültür ortamında çok hızlı ya da ilgi doku rahatsız olacak katmayın. Kapağın altında gaz değişimi için izin odası tamamen doldurmayın.
- Chamlide odasının üstünde görünmez kapağını yavaşça yerleştirin.
Bölüm 4: göz disk glial hücreleri göç Görselleştirme.
- Konfokal veya floresan mikroskobu aşamasında kültür odasına yerleştirin. Düşük büyütme bir referans olarak lamel daire kullanarak örnek bulun.
- 40x bir lens kullanarak örnek üzerinde odaklanın. Doku lamel üzerine yerleşmek için izin verin. Göz disk veya optik sapı 3-4 saat boyunca her 10-15dk görüntüler yakalayın. Doku seğirme ve odak dışında hareket edebilir. El görüntü yakalama önce doku odaklanarak inci hafifletmekbir sorundur.
Bölüm 5: Temsilcilik sonuçları:
Doğru şekilde gerçekleştirilmemesi, protokol bize göz hayali disk (Şekil 1 BD) optik sapı göç GFP etiketli glial hücreleri görüntüler bir dizi toplamak için izin verdi. 60 dakikalık bir süre için canlı görüntüleme, vahşi bir tür göz hayali disk içinde glial çekirdeğinin pozisyonlarda değişiklikleri gözlemlemek için yeterli iken, glial hücre geçiş için gerekli bir genin mutant glial çekirdekleri tamamen optik sapı (oklar çıkmak için başarısız Şekil 1 FH).
Biz kültür dokusunun bozulmasına gözlemleyerek önce 240 dakika gibi uzun süreler için kültürlü göz-beyin kompleksleri var. 240 dakikalık zaman noktası, GFP pozitif hücrelerin kültürlü göz-beyin kompleksler (ok Şekil 2 C) çevreleyen kültür ortamında gözlemlemek için başlar. Ayrıca GFP boyunca diffüz noktalar bir arıza doku bütünlüğü düşündüren dokularda birikir.
Şekil 1: gelişmekte olan yabani tip ve mutant ve görüntü sistemleri GFP etiketli glial çekirdekleri Canlı görüntüleme.
A, E) Görüntüler diferansiyel girişim kontrast (DIC), kültürlü yabani tip ve mutant göz hayali diskler (ED) mikroskopi kullanılarak çekilen . Vahşi tip, glial hücreler doğumlu ve göz-disk, optik sapı (OS) göç. Beyin, düzleşme ve göz hayali disk görüntüleme kolaylaştırmak için kaldırılmıştır. BD) (A) 0, 30 ve 60 dakikalık zaman noktalarında GFP etiketli glial çekirdekleri göz disk içinde göç ortaya koymaktadır vahşi tip kültür göz hayali disk Floresan mikroskopi.
FH) (E) 0, 30 ve 60 dakikalık zaman içinde GFP etiketli glial çekirdekleri durdurduklarını optik sapı (ok) gösteren mutant göz-beyin kompleks Floresan mikroskopi. (BR) beyin sapı içinde glia görüntüleme kolaylaştırmak için optik sapı bağlı bırakılmıştır.
Şekil 2: Canlı görüntüleme vahşi bir tür göz hayali disk GFP etiketli glial membranlarda. Biz başarıyla 240 dakikalık süreler için göz-beyin kültür kompleksleri var. Doku kültürü 240 dakikadan daha uzun yıkmak için başlar. 300 dakikalık bir zaman noktası (C) ile karşılaştırıldığında göz hayali disk çevresindeki kültür ortamı (ED), optik sapı (OS) ve 0 (A) ve 150 dakika (B) beyin lobu (BR), ücretsiz GFP pozitif hücreler, bir ok ile gösterilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol canlı mikroskopi kullanılarak göz hayali disk glial hücre göç gözlem açıklar. Vahşi tip örnek (Şekil 1 MS), bir saat boyunca göz disk glial hücre hareketi gözlemlemek için bir nükleer GFP işareti kullanılır. Şu anda bizim laboratuvarda çalışma kapsamında, glial hücre göçü için gerekli bir aday gen için bir mutant, biz (Şekil 1 EH) bir saatlik bir süre boyunca bir optik sapı içinde glial hücre çekirdeğinin durdurduklarını gözlemlenmiştir. Bizim stratejimiz ilgi gen tarafından düzenlenen hücresel davranışı daha detaylı görselleştirmek için adapte edilebilir. Örneğin, bir zar gibi mCD8-GFP, GFP molekülün hedeflenen hücre süreçlerini görselleştirmek için glia ifade edilebilir. Mutant glial hücreler filopodia gibi hücresel süreçleri göz disk içine uzanan yeteneğine sahip olup olmadığını belirlemek için izin verecek bir membran bağlı GFP marker kullanın. Benzer şekilde, GFP ile etiketlenen veya tubulin GFP ile etiketlenmiş aktin hücre iskeletinin glial hücre göçü sırasında değişiklikler görselleştirmek için gelişmekte olan glia ifade edilebilir. Ayrıca, tek GFP etiketli mutant glial hücrelerin incelenmesi canlı mikroskobu (6) kullanılarak görüntülendi olabilir. Bu teknik bize daha doğru göç glial hücreler düzenleyen ilgi gen gereği tanımlamak için izin verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Patrick Cafferty Kanada Multipl Skleroz Derneği bir doktora sonrası burs tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine | Reagent | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Schneider’s Insect Media | Reagent | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Penicillin-Streptomycin | Reagent | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Insulin solution from bovine pancreas | Reagent | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Chamlide Magnetic chamber | Tool | Live cell Instrument | CM-R-10 | 35 mm dish type chamber for 18 mm coverslip |
| Ultra fine clipper scissors | Tool | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Dumont #5 forceps | Tool | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fluorescent microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Any fluorescent imaging system that has the necessary filters and excitation for GFP can be used. |
References
- Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. Glial chain migration requires pioneer cells. J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).
- Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. Glial cell migration in the eye disc. J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Sepp, K. J., Auld, V. J. Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster. Genetics. 151, 1093-1101 (1999).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
