Summary
A continuación se describe un protocolo para examinar la migración de las células gliales en el desarrollo del ojo de Drosophila mediante el análisis microscópico directo emparejado con GFP etiquetados células gliales.
Abstract
Las células gliales de vertebrados e invertebrados organismos deben emigrar a las regiones de destino final para ensheath y apoyar las neuronas asociadas. Si bien el progreso reciente ha sido hecho para describir la migración en vivo de las células gliales en el ala en desarrollo pupal (1), los estudios de
Protocol
Parte 1: Pre-montaje experimental.
- Una semana de antelación, compañero de moscas para generar larvas que expresan GFP bajo el control de un promotor glial-específica. Para nuestro experimento visualizar GFP etiquetados con una secuencia de localización nuclear expresado en las células gliales con la polaridad invertida (repo) promotor (3, 4).
- Prepare la cubierta se desliza por lo menos un día antes en remojo 18 mm cubreobjetos redondos de 10 minutos en 1% de poli-L-lisina solución y el aire seco durante la noche.
- El día antes del experimento, una cámara limpia Chamlide cultura magnética en remojo toda la noche los componentes en el 70% de etanol.
- En el día del experimento, preparar un medio de cultivo mediante la adición de suero fetal bovino, la solución de penicilina-estreptomicina, y la insulina a 10 ml de medio de insectos de Schneider utilizando una técnica aséptica. Las concentraciones de trabajo son: 1X de suero fetal bovino, penicilina 100U/ml; 0.1mg/ml estreptomicina, y 0,2 mg / ml de insulina en el medio de los insectos de Schneider (modificado a partir de (5)).
- Permita que la cámara de cultivo se seque al aire en una campana de cultivos celulares. Lavar el etanol residual de la cámara de la cultura de un enjuague con medio de cultivo preparado.
Parte 2: La disección de la Drosophila ojo-cerebro complejo.
- Seleccione una larva de tercer estadio vagando de un lado de un vial de volar y el lugar en una gota de medio de cultivo refrigeradas en una placa de Petri en hielo durante varios minutos. El enfriamiento de la larva se recomienda para disminuir las contracciones peristálticas del cuerpo para facilitar la disección.
- Coloque la larva refrigerados en una gota de medio de cultivo en una placa recubierta Sylgard bajo un microscopio de disección.
- Bajo el microscopio de disección, utilice un par de pinzas Dumont bien para agarrar firmemente la larva aproximadamente un tercio de la distancia entre el extremo posterior. Espere hasta que la larva expulsa sus ganchos de la boca el extremo anterior. Sujete los ganchos de la boca con un segundo par de pinzas en toda su extensión. Para diseccionar la larva, tire lentamente de los dos pares de pinzas en direcciones opuestas. El complejo ojo-cerebro, junto con las glándulas salivales, los órganos de grasa y tejido imaginario, se retirará de la cuerpo de la larva. No tire los ganchos de la boca demasiado rápido de lo contrario se desprenda del complejo ojo-cerebro.
- Recorte las glándulas salivales, cuerpos grasos, y los discos imaginal con ultra-finas tijeras podadoras. Los dos hemisferios del cerebro y los discos de ojos se adjuntará a la cordón nervioso ventral y ganchos de la boca.
- Lugar un deslizamiento mm cubren 18 en un portaobjetos de vidrio. Dejar un borde de la hoja de la cubierta colgando del borde de la diapositiva con el fin de recoger más tarde la hoja de la cubierta. Añadir una gota de medio de cultivo en la hoja de cubierta de 18 mm. Transferir el complejo ojo-cerebro en el medio de cultivo agarrando los ganchos de la boca con unas pinzas. No comprenden el complejo ojo-cerebro directamente con las pinzas o el tejido dañado.
- Con la tijera fina disección, corte la boca ganchos del complejo del cerebro, ojos y desechar. La eliminación de los ganchos de la boca es importante para la imagen en vivo, como los ganchos de la boca seguirá contrayéndose en el medio de cultivo provoca que el tejido se mueva durante la microscopía.
- Para visualizar la migración gliales en el disco imaginal del ojo, corte con cuidado el tallo óptico, el tejido fino que conecta el cerebro y el disco de ojo y alejar o descartar el cerebro (ver figura 1A). Para visualizar las células de dentro del tallo óptico, dejar el cerebro, el tallo óptico, y el disco imaginal del ojo intacto (véase la Figura 1E).
- Levante el cubreobjetos con unas pinzas y dibujar un círculo debajo de todo el tejido de interés con un marcador permanente. Este círculo se ayuda en la localización de los tejidos para microscopia en la parte 4.
Parte 3: Montar el disco imaginal del ojo de una cámara de cultivo magnético.
- Con unas pinzas, agarre la punta colgando del cubreobjetos. Transferir el portaobjetos a la placa inferior de la cámara magnética Chamlide sin alterar el tejido de la cultura.
- Coloque el anillo de silicona en el cuerpo principal de la cámara Chamlide. Instalar el cuerpo principal en la parte superior de la placa inferior.
- Poco a poco agregue caldo de cultivo para la cámara. No agregue el caldo de cultivo muy rápido o el tejido de interés va a ser alterado. No llenar completamente la cámara para permitir el intercambio de gases en la cubierta.
- Con cuidado, coloque la tapa invisible en la parte superior de la cámara de Chamlide.
Parte 4: Visualización de la migración de las células gliales en el disco de los ojos.
- Coloque la cámara de cultivo en el escenario de un microscopio confocal o de fluorescencia. Localizar la muestra con el círculo en el cubreobjetos como referencia el bajo aumento.
- Se centran en la muestra usando una lente de 40x. Permitir que el tejido para resolver sobre el cubreobjetos. Captura de imágenes del disco óptico del ojo o el tallo cada 10-15min en 3-4 horas. El tejido puede contracción y se mueven fuera de foco. Manual de enfocar el tejido antes de la captura de imágenes aliviará ªes un problema.
Parte 5: Los resultados representativos:
Se realiza correctamente, el protocolo nos ha permitido recoger una serie de imágenes de la GFP-etiquetados células gliales que migraron desde el tallo óptica en el disco imaginal del ojo (Figura 1 BD). Mientras que imágenes en vivo durante un período de 60 minutos fue suficiente para observar los cambios en las posiciones de los núcleos gliales dentro de un tipo de disco imaginal del ojo salvaje, núcleos gliales en un mutante de un gen necesario para la migración de células gliales fracasado por completo para salir del tallo óptico (flechas Figura 1 FH).
Hemos cultivado el cerebro los ojos complejos para períodos de hasta 240 minutos antes de la observación de un deterioro de los tejidos cultivados. Después de los 240 minutos de duración punto empezamos a observar las células GFP positivos en el medio de cultivo circundantes cerebrales cultivadas ojos complejos (flecha Figura 2 C). Además de las buenas prácticas agrarias se acumulan en los puntos difusos a lo largo de los tejidos lo que sugiere una ruptura de la integridad del tejido.
Figura 1: Imágenes en vivo de la GFP-etiquetados núcleos gliales en el tipo de desarrollo salvaje y mutante sistemas visuales.
A, E) Las fotografías tomadas con contraste de interferencia diferencial (DIC) de microscopía de tipo salvaje y mutante cultivadas imaginal ojo-discos (ED). En la de tipo salvaje, las células gliales son nacidos dentro y migran desde el tallo óptico (OS) en el ojo de disco. El cerebro ha sido removido para facilitar el acoplamiento y la imagen del disco imaginal del ojo. BD) microscopia de fluorescencia del disco imaginal del ojo de tipo salvaje cultivadas en (A) a los 0, 30 y 60 minutos de tiempo pone de manifiesto los puntos GFP-etiquetados núcleos gliales migran dentro del disco del ojo.
FH) La microscopia de fluorescencia del mutante ojo-cerebro complejo (E) a los 0, 30 y 60 puntos de minutos de tiempo demuestra un estancamiento de la GFP-etiquetados núcleos gliales en el tallo óptico (flecha). El cerebro (BR), ha sido colocada en el tallo óptico para facilitar la obtención de imágenes de células gliales en el tallo.
Figura 2: Imágenes en vivo de las buenas prácticas agrarias con etiquetas de las membranas gliales en un tipo de disco imaginal del ojo salvaje. Hemos logrado cerebrales cultivadas ojos complejos para 240 minutos de períodos. Cultivos de tejido más de 240 minutos comienza a descomponerse. El medio de cultivo que rodean el disco imaginal del ojo (ED), tallo óptico (OS), y el lóbulo del cerebro (BR) a 0 (A) y 150 minutos (B), en comparación con los 300 minutos de duración punto (C), es gratis de las buenas prácticas agrarias de células positivas, indica con una flecha.
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Discussion
En este protocolo se describe la observación de la migración de células gliales en el disco imaginal del ojo mediante microscopía en vivo. En nuestro ejemplo, de tipo salvaje (figura 1 AD), se utilizó un marcador GFP nuclear para observar el movimiento de células gliales en el disco de los ojos en el transcurso de una hora. En un mutante de un gen candidato requerido para la migración de células gliales en la actualidad objeto de estudio en nuestro laboratorio, hemos observado un estancamiento de los núcleos de las células gliales en el tallo óptico durante un período de una hora (figura 1 EH). Nuestra estrategia se puede adaptar a visualizar con mayor detalle del comportamiento celular regulada por nuestro gen de interés. Por ejemplo, una membrana específica molécula GFP, como mCD8-GFP, se puede expresar en células gliales de visualizar los procesos celulares. El uso de un marcador GFP unido a la membrana que nos permitirá determinar si las células gliales en nuestros mutantes son capaces de extender los procesos celulares, tales como filopodios en el disco de los ojos. Del mismo modo actina etiquetados con las buenas prácticas agrarias o tubulina marcado con GFP podría expresarse en el desarrollo de las células de visualizar los cambios en el citoesqueleto durante la migración de células gliales. Además, el examen de un solo GFP marcado con células gliales mutante puede ser visualizada mediante microscopía en vivo (6). Esta técnica nos permite describir con mayor precisión la necesidad de nuestro gen de interés en la regulación de la migración de las células gliales.
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Acknowledgments
Patrick Cafferty es apoyado por una beca postdoctoral de la Sociedad de Esclerosis Múltiple de Canadá.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-L-lysine | Reagent | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Schneider’s Insect Media | Reagent | Sigma-Aldrich | S0146 | |
| Penicillin-Streptomycin | Reagent | Sigma-Aldrich | P4458 | |
| Insulin solution from bovine pancreas | Reagent | Sigma-Aldrich | I0516 | |
| Chamlide Magnetic chamber | Tool | Live cell Instrument | CM-R-10 | 35 mm dish type chamber for 18 mm coverslip |
| Ultra fine clipper scissors | Tool | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| Dumont #5 forceps | Tool | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fluorescent microscope | Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Any fluorescent imaging system that has the necessary filters and excitation for GFP can be used. |
References
- Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. Glial chain migration requires pioneer cells. J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).
- Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. Glial cell migration in the eye disc. J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Sepp, K. J., Auld, V. J. Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster. Genetics. 151, 1093-1101 (1999).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
