Summary
Хронологический старения у дрожжей относится к потере жизнеспособности клеток, связанных со временем в стационарной фазе. Здесь мы опишем высокой пропускной метод количественного определения дрожжей хронологическом продолжительность жизни.
Abstract
Почкующихся дрожжей
Protocol
Часть 1: Подготовка старения культур
- Подряд штаммов интерес из замороженных запасов на YEPD пластин агар (1% дрожжевой экстракт, 2% Бакто-пептон, 2% агара, 2% глюкозы).
- Инкубируйте клетки при 30 ˚ С в течение 48 часов или до отдельных колоний появится.
- Выберите одну колоний и переливая ее 5 мл YEPD жидкой среде (1% дрожжевой экстракт, 2% Бакто-пептон, 2% глюкозы) в пробирках.
- Рост культур течение ночи при 30 ˚ С, сохраняя при этом постоянную агитацию, используя либо шейкер или каток.
- Привить 5 мл синтетического полного (SC) среды (табл. 1) с 50 мкл ночной культуры. Вообще три SC культуры готовятся для каждого штамма обеспечить трех экземплярах биологической репликации анализ продолжительности жизни для каждого штамма изучается.
- Поддержание культур на 30 ˚ C с постоянной агитации на каток в течение всего эксперимента (обычно 2 или более недель).
Часть 2: С возрастом жизнеспособность точкой
После двух дней культуры в СК-средах, клетки должны быть в стационарной фазы и первые возрастные точки готова быть приняты. Последующие возрастные точки следует принимать каждые 2-3 дня в течение минимум двух недель. Для каждой возрастной точки:
- Подготовка Bioscreen 100-а сотовые пластины для прививки, заполняя каждую лунку со 145 мкл YEPD. Будьте уверены, чтобы оставить по крайней мере один хорошо заполнены только YEPD и нет клеток для анализа данных позже.
- Удалить старения культур из инкубатора.
- Кратко вихрь первой культуры, который будет инокулировали в сотовые пластины, стараясь не расплескать культуры.
- Удалить 5 мкл смешанной культуры и пипеткой его в первой скважины на сотовые пластины. Пламя устье каждой пробирке до и после удаления 5 мкл.
- Повторите эту процедуру для каждого старения культуры будучи уверенным отметить также положение, соответствующее каждой культуры. Идентичные также должности, должны быть использованы для каждой последующей возрастной точки на протяжении всего эксперимента.
- Замените культур в 30 ˚ C инкубатор, когда закончил с прививками.
Часть 3: Загрузка Bioscreen C MBR машины
- Expose отсек инкубатора, подняв крышку и снимите крышку к образцу лоток.
- Вставить новые прививки сотовые пластины в образец лоток (используйте левый слот, если вы только чтение одной пластины).
- Установите крышку на образец лоток и нижняя крышки отсека инкубатора.
- Убедитесь, что жидкий теплоноситель выше минимального уровня заполнения. Если низкий, добавьте больше, используя 1000 мкл пипетки с жидкий теплоноситель условии.
- Использование программного обеспечения Bioscreen "EZExperiment", установите следующие параметры для получения подходящей кривые роста CEREVISIAE Saccharomyces:
- Количество образцов: Введите количество скважин со средствами массовой информации или 200
- Фильтр: 420-580nm, широкополосный
- Температура: 30 ˚ C
- Эксперимент Длительность: 1 день, 0 часов, 0 секунд
- Измерение Интервал: 30 минут
- Shaking: На, непрерывная дрожь, высокая
- Нажмите кнопку "Пуск", чтобы начать чтение.
Часть 4: Анализ данных
Как правило, шести возрастных точках принимаются в течение двух недель. Возрастные точки, принятые на дни 2, 4, 6, 9, 11 и 13. В зависимости от опытно-конструкторских и штаммов проходят испытания, может быть желательно взять возрастные точки более или менее часто или в течение более 2 недель. Важно, чтобы загрузить сотовые пластины в том же порядке для каждой возрастной точки так, что каждая культура старения соответствует той же позиции и в любом возрасте-точка, так как это сделает анализ данных гораздо легче.
- Получить выходных файлов из машины Bioscreen C MBR. Программное обеспечение "EZExperiment" выведет Bioscreen данных с разделителями табуляции файл, совместимый с Microsoft Excel, а также другого программного обеспечения. Первая колонка показывает, в какое время измерения ОП было принято в ходе эксперимента, с последующим столбцов, представляющих каждую лунку в Bioscreen пластин Honeycomb (рис. 1).
- Удалить первом чтении OD от каждой колонки. Это чтение "шума".
- Нормализация данных, вычитая значение ОП хорошо с YEPD один из всех значений ОП в каждом столбце. Это устраняет фоне поглощения в средствах массовой информации.
- Участок результат кривых. Кривые изменится в зависимости от возраста (рис. 2). Например, путем построения кривых вырост из колонки 1 (1 и пластины сотовые) по шесть очков время, есть различные сдвиг вправо кривых с течением времени.
- Рассчитайте время удвоения (δ) для каждой скважины на основе кинетики роста день 2 возрастные точки. Уравнение для расчета времени удвоения яс:
где ОП 1 и 2 представляют OD последовательных измерений OD и Т 1 и Т 2 является время между измерениями. Рассчитать удвоение раз только между значениями ОП от 0,2 до 0,5. Среднее арифметическое этих значений Время удвоения, что хорошо. Рассчитать удвоение раз только между значениями ОП от 0,2 до 0,5. Среднее арифметическое этих значений Время удвоения, что хорошо. Большинство штаммов дикого типа дрожжей должно дать значение времени удвоения от 85 до 90 минут. - Для каждой возрастной точки, вычислить сдвиг во времени (Δt) в результате кривые по сравнению с начальной возрастной точки (день 2). Простой способ сделать это состоит в определении разницы в продолжительности времени, которое потребовалось для каждой лунки для достижения ОП 0,3 между начальным возрастом точкой и каждой последующей возрастной точки. Времени, конкретной скважины достигла 0,3 ОП может быть вычислена по линейное уравнение регрессии соответствующего п (ОП) как функцию времени между двумя временных точках брекетинг OD = 0,3.
- Рассчитать долю выживших в каждой возрастной точкой для того, чтобы генерировать выживания кривой (рис. 3). Определить начальный возраст точкой (день 2), чтобы быть на 100% жизнеспособность. Для каждой последующей возрастной точки вычислить процент выживаемости по следующей формуле:
где S N является выживание процент, Δt п сдвиг во времени, а δ п время удвоения. - Создание кривых выживаемости (рис. 3В) в соответствии с пожеланиями для каждой скважины (или повторить скважин), откладывая часть (или процент) жизнеспособных клеток в зависимости от возраста.
- Рассчитать выживания интеграл (СИ) для каждой скважины. С. И. определяется как площадь под кривой выживания и может быть оценена по формуле:
где возраст п возрастных точку (2, например, 4, 6, 9, 11 и 13) и S N является ценность для выживания в этом возрасте точки. - Определение статистических параметров повторить скважин с СИ и выживанию данных. Общие статистические параметры, представляющие интерес, включают среднее, медиана, и дисперсии для каждого набора биологических повторяет. Т-тест или подобный анализ может быть использован для попарного сравнения СИ для разных экспериментальных и контрольных групп. Он также может быть желательной для создания кривых выживаемости, как описано в 4,8 от усредненных биологических повторяет.
Часть 5: Представитель результаты
По завершении эксперимента, у вас будет построена кривая выживания и выполняется анализ данных достаточно, чтобы определить хронологический старения потенциал для нескольких различных штаммов или условий. Если выполнены должным образом, рост кривые, полученные из машины Bioscreen C MBR должен быть похож на тех, показано на рисунке 2 и в результате кривые выживания должна напоминать показанные на рисунке 3. Как правило, дикого типа клеток, культивированных в условиях, описанных здесь, имеют средний срок службы хронологического порядка 7 дней. Существенные изменения в выживаемости наблюдается в различных штаммов и при определенных условиях, таких как рост в 0,05% СМИ глюкозы, медиана выживаемости может превышать 30 дней.
Рисунок 1. Вывод данных из Bioscreen программы "EZExperiment". Колонка отображает время, в которое поглощения чтении принято не было. Последовательные столбцы представляют скважин сотовые пластины инокулированных клеток, взятых от старения культур.
Рисунок 2. Нарост кривых из одного биологического репликацию по ходу эксперимента. Существует явный сдвиг в кривых течением времени, как клетки в культуре старения теряют жизнеспособность. Период времени между начальной точкой времени (день 2) и последовательные момент времени определяет жизнеспособность в то определенного возраста.
Рисунок 3. А) кривая выживаемости генерируется с использованием данных из нарост рисунке 1. 2-й день временной точке устанавливается как 100% жизнеспособность точки. B) Окончательные кривые выживания двух штаммов в одном эксперименте. Эти кривые выживаемости представляют средний viabilities трех биологических повторяет для каждого штамма. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение в пределах биологических повторяет. Затененной области под кривой выживаемости представляет выживания интеграл (СИ) для штамма 1.
| Таблица 1. Синтетические определенной среде Используется для Хронологический старения (штамм backgrouой BY4743) | |
| Компонент | Концентрация (г / л) |
| D-глюкозы | 20 |
| Дрожжи азотистого основания (-AA/AS) | 1,7 |
| (NH 4) 2 SO 4 | 5,0 |
| Аденин | 0,04 |
| L-аргинин | 0,02 |
| L-Аспарагиновая кислота | 0,1 |
| L-глутаминовая кислота | 0,1 |
| L-Гистидин | 0,1 |
| L-лейцин | 0,3 |
| L-лизин | 0,03 |
| L-метионина | 0,02 |
| L-фенилаланин | 0,05 |
| L-серин | 0,375 |
| L-Треонин | 0,2 |
| L-триптофан | 0,04 |
| L-тирозин | 0,03 |
| L-валин | 0,15 |
| Урацил | 0,1 |
Примечание: Этот рецепт составляет auxotrophies в диплоидных BY4743 напряжения. Amino auxotrophies кислота должна быть компенсирована за счет добавления 5X, чтобы конечная концентрация синтетических полной среде.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Высокой пропускной хронологический срок службы анализа, описанного здесь, является эффективным методом для количественного старения потенциал большого числа штаммов с высокой точностью и точностью. Первичного продвижения этого метода по сравнению с классическими методами для определения выживания путем подсчета колониеобразующих единиц (см., например, 3) является использование устройств чтения шейкер / инкубатор / пластины, такие как машины Bioscreen C MBR для получения высокого разрешения кривые роста каждой возрастной точки. В прямом сравнении с низкой пропускной хронологическом анализов продолжительность жизни, этот метод был показан для достижения сопоставимой (или лучше) точностью, в то время как существенного увеличения количества образцов, которые могут быть проанализированы 4.
Метод, описанный выше, подходит для скрининга генетических вариантов для всех измененных хронологическом долголетия под культурой обычно используются условия для старения. Этот метод может быть легко адаптирована, однако, для альтернативных условий культуры, таких как предварительная адаптация к дыхательной роста (источник углерода глицерола) 5, содержание в воде, а не истек средства массовой информации, или исследования пищевых ограничений 4. Адаптация для фармакологических целей скрининга может быть также предусмотрено, например, путем добавления различных химических соединений из библиотеки старения средств массовой информации, а не прививки различных штаммов.
Метод, описанный здесь также обеспечивает гибкость в возрастных точек, используемых для жизни определении диапазона. Как описано выше, возрастные точки, принятые на дни 2, 4, 6, 9, 11 и 13 эксперимента. Эти возрастные точки пригодны для скрининга удаление дрожжей ORF коллекции мутантов с измененными продолжительность жизни, но не могут быть пригодны для других приложений, условия культивирования, или генетического происхождения. Следует отметить, однако, что если сравнение нескольких экспериментов желательно, тот же набор возрастных точках должны использоваться в каждом эксперименте.
В ходе проведения экспериментов хронологический промежуток жизни, мы должны отметить, что периодически подмножество клеток в старении культуры будет повторно ввести клеточного цикла, явление называют "задыхаясь '6. Задыхаясь можно наблюдать, как левый сдвиг кривой нарост на одном или более позднем возрасте, точки, соответствующие росту числа жизнеспособных клеток в процессе старения культуры. Культуры, где задыхаясь произошла должны быть исключены из анализа, если жизнеспособность уже достаточно низко, что последующие возрастные точки не окажет существенного влияния СИ.
Текущее техническое обслуживание машины Bioscreen C MBR необходимо для получения воспроизводимых и точных данных долголетия. Очень важно, чтобы жидкий теплоноситель остается выше минимального уровня заполнения, и это должно быть проверено перед каждым работать на машине. Это также полезно периодически чистить внутренние камеры инкубации, протирая лоток для удаления пыли создан непрерывный сотрясение сотовые плиты. Лампочка будет также необходимо заменить один или два раза в год. F1.b2 сообщение об ошибке указывает на недостаточный свет от лампочки. Это хорошая идея, чтобы сохранить несколько запасных луковиц на руку.
Идентификации мутантов и химические вещества, которые изменяют продолжительность жизни в простых эукариотов была движущей силой в процессе старения исследования в течение последних нескольких лет. Особый интерес представляют те мероприятия, которые медленного старения во эволюционно расходящихся видов. Хронологическом методологии продолжительность жизни, описанные здесь внесла свой вклад в наше понимание основных механизмов старения в почкующихся дрожжей и выявлению новых объектов долголетия факторов, которые в конечном итоге может оказаться полезной в качестве терапевтических мишеней для лечения возраст-ассоциированных заболеваний у людей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH Грант 1R21AG031965-01A1. МК Эллисон Медицинский фонд Новый ученый в процессе старения.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Peptone | Reagent | BD Biosciences | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | Reagent | BD Biosciences | 288620 | |
| Difco Agar | Reagent | BD Biosciences | 214530 | |
| Yeast Nitrogen Base w/o A.A. and A.S. | Reagent | MidSci | J630-500G | |
| Amino Acids | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Ammonium Sulfate | Reagent | Spectrum | AM185 | |
| Dextrose | Reagent | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Bioscreen C MBR machine | Tool | Growth Curves USA | 5101370 | |
| Bioscreen 100-well Honeycomb plate | Tool | Growth Curves USA | 9502550 |
References
- Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Replicative aging in yeast: the means to the end. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29 (2008).
- Kaeberlein, M. Handbook of models for human aging. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109 (2006).
- Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73 (2003).
- Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113 (2008).
- Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast. Mech Ageing Dev. 127 (9), 733 (2006).
- Fabrizio, P., et al. Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 166 (7), 1055 (2004).
