Summary
Kronologiska åldrande i jäst avser förlust av cellernas livskraft i samband med tiden i stationär fas. Här beskriver vi en hög genomströmning metod för att kvantitativt bestämma jäst kronologisk livslängd.
Abstract
Den spirande jäst
Protocol
Del 1: Förberedelser av åldrande kulturer
- Streak stammar av intresse från frysta lager på YEPD agarplattor (1% jästextrakt, 2% Bacto-pepton, 2% agar, 2% glukos).
- Inkubera cellerna vid 30 ˚ C i 48 timmar eller tills enstaka kolonier visas.
- Välj enstaka kolonier och inokulera i 5 ml YEPD vätska (1% jästextrakt, 2% Bacto-pepton, 2% glukos) i provrör.
- Väx kulturer över natten vid 30 ˚ C samtidigt konstant omrörning med hjälp av antingen en shaker eller roller trumma.
- Inokulera 5 ml av syntetiska kompletta (SC) medium (tabell 1) med 50 mikroliter av natten kulturen. Generellt tre SC kulturer upprättas för varje stam för att ge tre exemplar biologiska replikering av livslängden analys för varje virusstam som undersöks.
- Bibehålla kulturerna vid 30 ˚ C med konstant omrörning på en rulle trumma för hela försöket (i allmänhet 2 eller flera veckor).
Del 2: Med en bärkraft ålder-punkt
Efter två dagars kultur i SC medier, bör de celler vara i stationär fas och den första ålders-punkten är redo att tas. Efterföljande ålder-punkter bör tas varje 2-3 dagar i minst två veckor. För varje ålder punkt:
- Förbered Bioscreen 100-väl Honeycomb plattor för ympning genom att fylla varje brunn med 145 mikroliter av YEPD. Var noga med att lämna minst en brunn fylld med bara YEPD och inga celler för analys av data senare.
- Ta bort den åldrande kulturer från inkubatorn.
- Kortfattat virvel den första kulturen som skall inokuleras i Honeycomb plattan, samtidigt som det är noga med att inte spilla av kulturen.
- Ta bort 5 mikroliter av den blandade kulturen och pipett in den första brunnen i Honeycomb plattan. Flame mynningen av varje provrör före och efter bort 5 mikroliter delmängd.
- Upprepa proceduren för varje åldring kultur är noga med att notera väl läge som motsvarar varje kultur. Identiska väl ståndpunkter bör användas för varje påföljande år-punkt under hela experimentet.
- Byt kulturer i 30 ˚ C inkubator när du är klar med vaccinationer.
Del 3: Ladda Bioscreen C MBR maskin
- Exponera inkubatorn facket genom att lyfta på locket och ta av locket till provet facket.
- Sätt in den nya inokulerade Honeycomb plattan i provbricka (använd den vänstra platsen om du bara läser en tallrik).
- Sätt tillbaka locket till provbricka och lägre locket till inkubatorn facket.
- Kontrollera att köldbärarvätskan är över den lägsta fyller nivå. Om låg, lägger till fler med hjälp av en 1000 mikroliter pipett med värmen som köldbärarvätskan.
- Använda Bioscreen programvara "EZExperiment", ställ in följande parametrar för att få lämpliga tillväxtkurvor för Saccharomyces cerevisiae:
- Antal prover: Ange antalet brunnar med media eller 200
- Filter: 420-580nm, Wideband
- Temperatur: 30 ˚ C
- Experiment Längd: 1 dag, 0 timmar, 0 sekunder
- Mätintervall: 30 minuter
- Shaking: På ständig skakning, Hög
- Klicka på "Start" för att börja avläsningar.
Del 4: Data Analysis
Normalt är sex år-poäng tagit över loppet av två veckor. Den ålder-poäng tas på dag 2, 4, 6, 9, 11 och 13. Beroende på experimentell design och stammar som testas, kan det vara önskvärt att ta ålder poäng mer eller mindre ofta eller under längre tid än två veckor. Det är viktigt att ladda Honeycomb plattan i samma ordning för alla åldrar-punkt så att varje åldring kulturen motsvarar samma bra läge i alla åldrar-punkt, eftersom detta kommer att göra analys av data mycket enklare.
- Skaffa ut filerna från Bioscreen C MBR maskin. Programvaran "EZExperiment" kommer ut den Bioscreen data som en tabbavgränsad fil som är kompatibel med Microsoft Excel och andra program. Den första kolumnen visar vilken tid OD mätningen togs under försöket, med efterföljande kolumner som representerar varje bra i Bioscreen Honeycomb plattorna (Figur 1).
- Ta bort den första OD läsning från varje kolumn. Denna läsning är "brus".
- Normalisera data genom att subtrahera OD-värde på bra med YEPD ensam från alla OD-värden i varje kolumn. Detta tar bort bakgrundsabsorbansen av media.
- Plotta utväxt kurvor. Kurvorna kommer att flytta som en funktion av ålder (figur 2). Till exempel genom att rita en utväxt kurvorna från kolumn 1 (väl en av de Honeycomb plåt) under de sex tidpunkter, det finns en distinkt åt höger förskjutning av kurvorna över tiden.
- Beräkna fördubbling tid (δ) för varje baserad på god tillväxt kinetik för dag 2 ålders-punkt. Ekvationen används för att beräkna fördubbling gången jags:
där OD 1 och OD 2 representera efterföljande OD mätningar och t 1 och t 2 är den tid mellan mätningarna. Beräkna fördubbling gånger bara mellan OD-värdena 0,2 till 0,5. Medelvärdet av dessa värden är den fördubbling tid för det också. Beräkna fördubbling gånger bara mellan OD-värdena 0,2 till 0,5. Medelvärdet av dessa värden är den fördubbling tid för det också. De flesta vildtyp jäststammar bör ge ett värde fördubbling tid mellan 85 till 90 minuter. - För varje ålder-punkt, beräkna den tidsförskjutning (Dt) i utväxt kurvorna för de första ålders-punkt (dag 2). Ett enkelt sätt att göra detta är att fastställa skillnaden i hur lång tid det tog för varje brunn för att mellan de första ålders-punkt och varje efterföljande år-punkt når en OD på 0,3. Den tid som en viss väl nått en OD 0,3 kan beräknas från den linjära regressionsekvationen motsvarar ln (OD) som en funktion av tiden mellan de två tid-punkter gaffling OD = 0,3.
- Beräkna andelen överlevande vid varje ålder-punkt för att generera en överlevnad kurva (Figur 3). Definiera den första ålders-punkt (dag 2) att vara 100% livskraft. För varje följande år-punkt beräkna procent överlevnad med hjälp av ekvationen:
där s n är överlevnad procent, är Dt n att tidsförskjutningen, och δ n är en fördubbling tid. - Generera överlevnadskurvorna (Figur 3B) som önskas för varje bra (eller replikera brunnar) genom att plotta fraktion (eller procent) livskraftiga celler som funktion av ålder.
- Beräkna överlevnad integrerad (SI) för varje brunn. SI definieras som ytan under överlevnad kurvan och kan uppskattas med formeln:
där ålder n är ålders-punkt (t.ex. 2, 4, 6, 9, 11 och 13) och s n är överlevnadsvärde i den åldern-punkten. - Bestäm statistiska parametrar replikera brunnar från SI och överlevnadsdata. Vanliga statistiska parametrar av intresse medelvärde, median, och varians för varje uppsättning av biologiska replikat. Ett t-test eller liknande analys kan användas för parvisa jämförelsen av SI för olika försöksgrupp och kontrollgrupp. Det kan också vara önskvärt att generera överlevnadskurvorna, som beskrivs i 4.8 från i genomsnitt biologiska replikat.
Del 5: representativa resultat
Vid slutförandet av experimentet, har du ritas överlevnad kurvan och utförde analys av data tillräckligt för att bestämma den kronologiska åldrande potential i flera olika stammar eller villkor. Om det utförs på rätt sätt bör tillväxten kurvor erhålls från Bioscreen C MBR maskin liknar de som visas i figur 2 och den resulterande överlevnadskurvorna bör likna de som visas i figur 3. I allmänhet kommer vildtyp celler odlade på de villkor som beskrivs här har en median span kronologisk livet på order av 7 dagar. Stor variation i överlevnad har observerats i olika stammar och under vissa villkor, såsom tillväxt 0,05% glukos media, kan medianöverlevnad överskrida 30 dagar.
Figur 1. Datautgång från Bioscreen programmet "EZExperiment". Kolumn A visar den tidpunkt då en absorbans läsning togs. Successiva kolumner representerar brunnarna i Honeycomb plattan inokuleras med cellerna tas från äldre kulturer.
Figur 2. Utväxt kurvor från en enda biologisk replikera under loppet av ett experiment. Det finns en tydlig förändring i kurvorna över tid som celler i den åldrande kulturen tappar livskraft. Den tid mellan den första tidpunkten (dag 2) och en efterföljande tidpunkt avgör lönsamheten vid en viss ålder.
Figur 3. A) En överlevnad kurva genereras med utväxt data från Figur 1. Dagen 2 tidpunkt anges som 100% livskraft punkt. B) Sista överlevnadskurvorna av två stammar testas på samma experiment. Dessa överlevnadskurvorna representerar genomsnittet viabilitet av tre biologiska replikat för varje stam. Felstaplar representerar standardavvikelsen inom biologiska replikat. Det skuggade området under överlevnad kurvan representerar överlevnad integrerad (SI) för stam 1.
| Tabell 1. Syntetiska Definierade medium som används för kronologiska åldrande Studies (stam background BY4743) | |
| Komponent | Koncentration (g / L) |
| D-glukos | 20 |
| Jäst kväve bas (-AA/AS) | 1,7 |
| (NH 4) 2 SO 4 | 5,0 |
| Adenin | 0,04 |
| L-arginin | 0,02 |
| L-Asparaginsyra | 0,1 |
| L-glutaminsyra | 0,1 |
| L-histidin | 0,1 |
| L-Leucin | 0,3 |
| L-Lysin | 0,03 |
| L-Metionin | 0,02 |
| L-Fenylalanin | 0,05 |
| L-Serine | 0,375 |
| L-treonin | 0,2 |
| L-Tryptofan | 0,04 |
| L-Tyrosin | 0,03 |
| L-Valin | 0,15 |
| Uracil | 0,1 |
Notera: Detta recept står för auxotrophies i diploid BY4743 stam. Aminosyra auxotrophies bör kompenseras för genom att lägga till en 5X slutlig koncentration till den syntetiska hela mediet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den höga genomströmning kronologisk livslängd analys som beskrivs här är en effektiv metod för att kvantifiera den åldrande potentialen av ett stort antal stammar med hög noggrannhet och precision. Den primära god tid före denna metod under klassiska metoder för att bestämma överlevnad genom att räkna kolonibildande enheter (se t.ex. 3) är att använda en shaker / inkubator / platta behandlingen enhet som Bioscreen C MBR maskin för att få högupplösta tillväxtkurvor på varje ålder-punkt. I direkt jämförelse med låg genomströmning span kronologisk liv analyser har denna metod visat sig uppnå jämförbara (eller bättre) precision, samtidigt kraftigt öka antalet prov som kan analyseras 4.
Metoden som beskrivs ovan är lämplig för screening genetiska varianter för förändrad kronologisk livslängd under vanliga kulturen villkor för åldrande studier. Denna metod kan lätt anpassas dock för alternativ kultur villkor, såsom pre-anpassning till luftvägarna tillväxt (glycerol kolkälla) 5, underhåll i vatten i stället gått ut media eller studier av dietrestriktioner 4. Anpassning för farmakologisk screening kan också vara tänkt, till exempel genom att lägga till olika kemiska föreningar från ett bibliotek till den åldrande medierna snarare än inokulering olika stammar.
Metoden som beskrivs här också ger flexibilitet i åldern poäng för livslängd beslutsamhet. Som beskrivits ovan är åldersrelaterad punkter tas på dag 2, 4, 6, 9, 11 och 13 i experimentet. Dessa ålder-poäng är lämpliga för screening jästen ORF raderingen kollektion för mutanter med förändrad livslängd, men kanske inte passar för andra tillämpningar, förutsättningar kultur, eller genetiska bakgrund. Det bör dock noteras att om jämförelsen mellan flera experiment önskas, bör samma uppsättning av ålder-poäng kan användas i varje försök.
Under utföra kronologisk experiment livslängd, har vi noterat att periodvis en delmängd av celler i den åldrande kulturen kommer tillbaka in i cellcykeln, som ett fenomen som "kippar" 6. Flämtar kan observeras som en vänstervridning i utväxt kurvan vid ett eller flera senare ålder-poäng, vilket motsvarar en ökning av antalet livskraftiga celler i den åldrande kulturen. Kulturer där flämtar har inträffat bör tas bort från analysen, om inte lönsamheten redan är tillräckligt låg för att senare ålder-poäng inte nämnvärt kommer att påverka SI.
Rutinmässigt underhåll av Bioscreen C MBR maskinen är nödvändigt att få reproducerbara och exakt livslängd data. Det är viktigt att köldbärarvätskan hålls över den lägsta fyller nivå och detta bör kontrolleras före varje kör på maskinen. Det är också bra att regelbundet rengöra insidan av inkubationstiden kammare genom att torka facket att ta bort damm som skapats genom kontinuerlig skakning av Honeycomb plattorna. Lampan kommer också att behöva bytas ut en eller två gånger om året. Ett F1.b2 felmeddelande anger otillräcklig ljuset från lampan. Det är en bra idé att hålla flera extra lampor till hands.
Identifieringen av mutanter och kemikalier som påverkar livslängden i enkla eukaryoter har varit en drivande kraft i äldre forskning under de senaste åren. Av särskilt intresse är de insatser som långsamma åldrande över evolutionärt skilda arter. Den kronologiska livslängd metod som beskrivs här har bidragit till vår förståelse av grundläggande mekanismer åldrande i spirande jäst och identifiering av faktorer roman livslängd vilket i slutändan kan visa sig användbart som terapeutiska mål för behandling av åldersrelaterad associerade sjukdomar hos människor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH Grant 1R21AG031965-01A1. MK är en Ellison Medical Foundation Nya Scholar i åldrande.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Peptone | Reagent | BD Biosciences | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | Reagent | BD Biosciences | 288620 | |
| Difco Agar | Reagent | BD Biosciences | 214530 | |
| Yeast Nitrogen Base w/o A.A. and A.S. | Reagent | MidSci | J630-500G | |
| Amino Acids | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
| Ammonium Sulfate | Reagent | Spectrum | AM185 | |
| Dextrose | Reagent | Fisher Scientific | D16-10 | |
| Bioscreen C MBR machine | Tool | Growth Curves USA | 5101370 | |
| Bioscreen 100-well Honeycomb plate | Tool | Growth Curves USA | 9502550 |
References
- Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Replicative aging in yeast: the means to the end. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29 (2008).
- Kaeberlein, M. Handbook of models for human aging. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109 (2006).
- Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73 (2003).
- Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113 (2008).
- Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast. Mech Ageing Dev. 127 (9), 733 (2006).
- Fabrizio, P., et al. Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 166 (7), 1055 (2004).
