Nuclear Transfer naar Mouse Eicellen

Summary

Deze film en het protocol zijn bedoeld om te leren nucleaire transfer.

Abstract

Kernenergie te zetten in een onbevruchte eicel kan herstellen ontwikkelingsstoornissen potentieel om een ​​gedifferentieerde cel. Dit toont aan dat de processen die ten grondslag liggen ontwikkeling, differentiatie en veroudering zijn epigenetische in plaats van genetische processen. De omkeerbaarheid van deze processen opent opwindende perspectieven in fundamenteel onderzoek, en in de verdere toekomst, in de regeneratieve geneeskunde. In de muis, kunnen embryonale stamcellen worden afgeleid uit gekloonde embryo's pre-implantatie fase. Dergelijke embryonale stamcellen hebben het vermogen om aanleiding te geven tot alle celtypes van het volwassen organisme. Belangrijk is dat deze cellen zijn genetisch identiek aan de donor. Indien van toepassing op de mens, zou dit mogelijk de winning van stamcellen uit een patiënt. Deze cellen kunnen vervolgens worden onderverdeeld in de getroffen celtype van de patiënt en bestudeerd in vitro, of worden gebruikt om de beschadigde of ontbrekende cellen te vervangen. De studie van nucleaire transfer in de muis blijft belangrijk want het kan ons informeren over de principes van de nucleaire herprogrammering. Deze film en de bijbehorende protocol zijn bedoeld om het leren nucleaire transfer in de muis, een methode in eerste instantie ontwikkeld in de groep van prof. dr. Yanagimachi (Wakayama et al.. 1998).

Protocol

Voorbereidingen:

1. Een gedetailleerde beschrijving van superovulatie en MicroDrop embryo cultuur kunnen elders ² te vinden.
2. Bereid een petrischaal met microdruppels van embryo cultuur medium (bijv. KSOM, Chemicon). Dek af met minerale olie (minerale olie batches moet worden getest op compatibiliteit met embryo cultuur). Evenwicht bij 37 ° C in de lucht, vermeerderd met 5% CO _2. (In Thermo Electron-3110 watermantel incubator of gelijkwaardig)
3. Bereiden een gerecht voor de isolatie van eicellen: Plaats druppels HEPES-gebufferde CZB en hyaluronidase (0,1% w / v, Sigma) in een helft van de schotel en HCZB in de andere helft. Dek af met minerale olie. Hou de schotel warm op een verwarmde stadium van een dissectie microscoop.
4. Bereid de microscoop: Plaats een holding pipet van een buitendiameter van ongeveer 50 μ m (iets kleiner dan de diameter van de eicel) en een opening van ongeveer 20 μ m in een pipet houder. Holding pipetten zijn makkelijk te maken met de nodige apparatuur, een naald trekker (Sutter Instruments) en een microforge (Narishige), maar ze kunnen ook worden gekocht bij Humagen.
   
   Laad 3-5 μ l kwik in de staart van een micropipet (inwendige diameter 8 μ m). Voorkomen dat kwik morsen. Bereid een schotel met verschillende kleine druppels elk van de 11% w / v PVP (polyvinylpyrrolidon) in HCZB en 5 μ g / ml cytochalasine B in HCZB. Gebruik het deksel van een petrischaal in plaats van de schotel zelf als het deksel heeft een korte rand die niet interfereren met de beweging van het bedrijf en de enucleatie pipetten. Lijn de holding pipet en de enucleatie pipet in een HCZB drop. Aspireren een beetje HZCB in de punt van de holding pipet.
5. Voorbereiding van de donor cellen hangt grotendeels af van het celtype en het experiment de onderzoeker voornemens is te verrichten. In het algemeen moet donor cellen worden behandeld met een proteolytisch enzym, zoals trypsine en bewaard op ijs om kleverigheid te verminderen tot overdracht.
6. Humaan euthanaseren muizen 14-15 uur na de toediening van hCG. Oogst eileiders en ontleden ze in de warme HCZB-hyaluronidase druppels. Na ca.. 5 min, zullen eicellen worden meestal vrij van cumulus cellen. Ze moeten dan enkele malen gewassen in HCZB, dan verder gewassen in de pre-evenwicht KSOM drops, en bewaard in de couveuse tot enucleatie.

Enucleatie

Manipulaties worden uitgevoerd met hydraulische micromanipulators, (Narishige) op een omgekeerde microscoop, zoals de Nikon TE200. Een piezo micromanipulator (Primetech) wordt gebruikt voor het boren van de zona pellucida. Platte enucleatie en overdracht pipetten zijn verkrijgbaar bij Humagen. Reinig en smeer de enucleatie pipet in de PVP daalt verdrijven microscopisch kwik druppels en door het opzuigen en verdrijven PVP. Om te voorkomen dat kleverigheid van de naald, moet dezelfde procedure worden gedaan tussen elke groep van eicellen die ofwel enucleated of overgedragen.

Plaats een kleine groep van eicellen in de HCZB-cytochalasine B drop. De grootte van de groep moet worden aangepast aan het niveau van de ervaring van de onderzoeker. Eicellen mogen niet worden bewaard op het podium langer dan 20-30 min. Verplaats de instrumenten om de HCZB-cytochalasine B daalt. De holding pipet en de enucleatie pipet moet worden gebracht in lijn met het equatoriale vlak van de eicel. Dit wordt mogelijk als de holding pipet heeft een buitendiameter die iets kleiner is dan de eicel zelf. Draai een eicel tot aan de verschillend refractieve metafase spindel kan worden gezien. Als een beginner niet kan zien van de as, kan de metafase plaat worden geïdentificeerd met behulp van de DNA-kleurstof Hoechst en UV-verlichting, echter, die niet compatibel is met efficiënte embryonale ontwikkeling. Plaats de metafase spindel bij drie en goed houd het met het bedrijf pipet. Van toepassing zijn piëzo pulsen aan de zona pellucida te dringen. Raak de metafase plaat met de enucleatie pipet. Zodra de weerstand van de metafase spindel kan 'gevoeld', zuigen de spindel en trek de naald. De eicel cytoplasma vloeistof is, de metafase spindel beweegt echter wel als een groepje bij aanraking met de pipet. Probeer om de hoeveelheid cytoplasma dat is verwijderd met de spindel te verminderen. Na een groep van eicellen is enucleated, was ze door middel van embryo kweekmedium en plaats ze in de couveuse tot overdracht. Sommige enucleated eicellen mogen niet worden overgedragen, maar moeten worden geactiveerd en dienen als een controle voor enucleatie. Deze eicellen zullen fragment binnen enkele uren, wat aangeeft succesvol enucleatie.

Kerntransfer

Plaats cellen in PVP-oplossing (11% PVP in HCZB). Als er veel klonen arrestatie aan de een-cellig stadium, moet de PVP concentratie worden verlaagd tot 5% of minder. Meng cellen goed with PVP. Pick-up cellen met een pipet met een inwendige diameter van iets kleiner dan de diameter van de cel. Het membraan van de cel zou moeten breken op aspiratie. In sommige gevallen kunnen herhaalde verdrijven en aspiratie, alsmede de toepassing van zachte piëzo-pulsen worden gebruikt om de donor cel te breken. Een nieuwe daling van de donor-cellen moeten worden gemaakt met elke groep van eicellen worden overgedragen, als donor cellen kleverig na verloop van tijd. Injecteer de gebroken donorcel kort na het breken van de membraan. Voor de overdracht, richten zich op het equatoriale vlak van de eicel zelf in plaats van het equatoriale vlak van de zona pellucida, en plaats de overdracht en de holding pipet in hetzelfde vlak. Houd de eicel, waaronder een deel van zijn cytoplasma stevig. Dringen in de zona pellucida met behulp van piëzo-pulsen. Breng de donor kern aan het uiteinde van de pipet, druk dan op de pipettip bijna aan de andere kant van de enucleated eicel, dicht bij het bedrijf pipet, het maken van een diepe groef in de eicel. Aspireren een zeer kleine hoeveelheid van de eicel cytoplasma in de pipet, breng dan een enkele zwakke piezo impuls naar de eicel membraan te breken, verwijdert u de donorkern, snel terugtrekken van de naald, terwijl aspireren in de cytoplasmatische membraan aan de rechterkant van de groef. Door het gelijktijdig intrekking van de naald en het aanzuigen, moet het mogelijk zijn om het gat achtergelaten door NT te sluiten. Dit 'gat verwijderen van techniek zal het aantal eicellen dat lyse tijdens de NT. Was de gereconstrueerde eicellen in KSOM en stuur ze terug naar de incubator gedurende 1-3 uur.

Eicelactivatie

Bereid een helft van een schotel met druppels van calcium vrij MCZB en de andere helft met druppels van calcium vrij MCZB plus 10 mM Sr ^{2 +} en 5 μ g / ml cytochalasine B naar polaire lichaam extrusie remmen. Equilibreren gedurende 30 minuten. onder de 5% CO ² in de lucht. Goed wassen NT embryo's in calcium-vrije MCZB en deze vervolgens plaats in kleine groepen in verschillende druppels van calcium-vrije MCZB. Zet de schotel naar de incubator en cultuur voor 5-6 uur. Om te controleren voor de kunstmatige activering protocol en voor embryo kweekomstandigheden, moeten niet-enucleated eicellen worden gebruikt. Zij zullen ontwikkelen als parthenogenetische embryo's. Na activering, was de embryo's door middel van KSOM en plaats embryo's in de incubator voor de lange termijn cultuur. Pronuclei moet duidelijk zichtbaar zijn op dit tijdstip, met vermelding van een succesvolle overdracht.

Embryo Cultuur Media Cookbook

Master Zouten

Begin met 980 ml ​​ultrapuur H ₂ O in steriele 1 L fles

Voeg droge componenten:

NaCl 4760 mg (81mm) Sigma S-5886
KCl 360 mg (5mm) Sigma P-5405
MgSO ₄ • 7H ₂ O 290 mg (1.18mM) Sigma M-2773
KH ₂ PO ₄ 160 mg (1.17mM) Sigma P-5655
EDTA 2Na 40 mg (0,1 mm) Sigma E-6635
Glucose (D) 1000 mg (5,5 mm) Sigma G-6152

Voeg liquide componenten

Na-lactaat (melkzuur) 5,3 ml & nbsp; Sigma 44263
Pen'Strep 10 mL Gibco 15140-122

Voor MCZB Stock Zouten:

Filter steriliseren 500 ml meester zouten (goed voor 3-4 maanden; bewaren bij 4 ° C)

Voor HCZB Stock Zouten:

Begin met 500 ml meester zouten

Voeg 50 mg PVA (koud oplosbaar; Sigma P-8136)

Roer voor de 30-60 min en steriele filter (goed voor 3 maanden; bewaren bij 4 ° C)

Ca ^{+ +} Gratis MCZB (voor de eicellen activering in 5% CO ₂₎

Begin met 99 ml MCZB voorraad zouten

Voeg droge componenten:

NaHCO ₃ 211 mg Sigma S-5761

Na-pyruvaat (pyrodruivenzuur) 3 mg Sigma P-4562

L-Glutamine 15mg Sigma G-8540

Bovine serum albumine (BSA) 500 mg Sigma A-3311

Zwenken totdat alle componenten zijn opgelost; steriel filter.

HCZB (voor micromanipulatie in omgevingslucht)

Begin met 99 ml HCZB voorraad zouten

Voeg droge componenten:

Hepes-Na 520 mg Sigma H-3784

NaHCO ₃ 42 mg Sigma S-5761

Voeg liquide componenten:

128 mM CaCl ₂ (18.8g / l) 1 ml Sigma C-7902

Pas de pH op 7,5 met 1 N HCl

Swirl totdat het is opgelost; steriel filter.

Discussion

Good luck!

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytochalastin B	Sigma-Aldrich		100x stock = 500 µg/ml Cytochalasin B in DMSO. Store at -20 ˚C.
Strontium Chloride			10x stock = 100 mM SrCl2 in H2O. Store at room temperature.
MCZB Stock Salts			Filter sterilize 500 ml master salts (good for 3-4 months; store at 4 ˚C)
HCZB Stock Salts			Start with 500 mL master salts. Add 50 mg PVA. Stir for 30-60 min and sterile filter (good for 3 months; store at 4 ˚C).
PVA	Sigma-Aldrich	P-8136	cold-soluble
HCZB with 11% w/v PVP			Start with 20 ml HCZB medium in a 50 ml conical tube. Place 22 g PVP on top of liquid. Close tube and store undisturbed at 4 ˚C for 72 – 96 hr, at which time the PVP will have entered solution. Filter sterilize through an 8 mm filter and store at 4 ˚C.
PVP	ICN Biomedicals		MW 360,000
Please check for additional buffers compositions in the Protocol part.