Biology

大容量（20L）过滤沿海海水样品

Published: June 18, 2009 doi: 10.3791/1161

David A. Walsh¹, Elena Zaikova¹, Steven J. Hallam¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

Summary

此视频文件体积大（≥20 L）的过滤，微生物生物量，0.22μm的直径2.7μm之间不等，从水柱。

Abstract

工作流程开始与下游微生物群落的沿海海域，养分和微量气体分析的集合。对于这种方法，样品均采自HMS施德Saanich入口经营甲板。此视频文件体积大（≥20 L）的过滤，微生物生物量，0.22μm的直径2.7μm之间不等，从水柱。使用单泵机组配有4个旋转磁头，两个20L样品可同时进行过滤。过滤是在延长旅行领域，或后立即一日游的回报。穿过每一个sterivex过滤装置，重要的是要记录的水量。为了防止生物膜之间的采样人次的形成，所有的过滤设备，必须用稀盐酸和去离子水冲洗，高压灭菌后立即使用。此过程将需要大约5个小时，加上清理的额外小时。

Protocol

设置过滤装置
1. 要设置过滤装置，使用镊子放入一个档次的GF / D转换过滤器的预过滤器的公屋单位。松散地用手拧紧的住房。作为一个经验法则，不要过分拧紧或单位将泄漏一旦开始抽水。
2. 请小心插入carboy没有接触它的内部管蒸压帽和连接管的carboy第。如果必要，请使用镊子引导carboy管。
3. 通过蠕动泵外部的油管。
4. 将预过滤器的公屋单位都管（即2％carboy单位）外部年底。用钳子拧紧连接。
海水过滤
1. 要开始过滤海水，打开泵和流动速度设置为1。观察，以确保水是被抽在正确的方向。
2. 允许加水500毫升，通过预过滤单元和成1升烧杯中自由流动。
3. 关闭泵，和自由端的预过滤器安装在一个附加Sterivex的过滤器，男性露儿装修。用手拧紧的预过滤住房紧贴。
4. 观看的预过滤器的外壳和连接之间的预过滤器住房和油管，导致该carboy。如果发生泄漏，打开泵和放松，并相应地重新拧紧预过滤住房。转动泵回。
5. 4升烧瓶收集滤液。一旦他们都满了，空到一个干净carboy的烧瓶。一定要注意通过每一个过滤器的体积。收集滤液，可进一步处理，如病毒过滤，。
6. 继续筛选，直到没有水留在carboys。通常的过滤时间4-5小时/ 20升carboy的范围，但是，这取决于生物质内水适量显着。
7. 过滤完成后，切换泵的关闭和断开Sterivex过滤器。
储存过滤器
1. 要存储的过滤器，首先驱逐任何剩余的水30-60毫升注射器。
2. 使用吸液管，添加1.8毫升裂解液过滤器，保持在后来试剂的过滤器〜200 UL空间。
3. 小块的封口膜密封的顶部和底部的Sterivex过滤器和标签的日期和样品标识的过滤器。
4. 商店预先标记50毫升猎鹰管过滤器在-80 ° C
5. 从房屋单位中删除的过滤器和它们放入标记含有裂解液2毫升50毫升猎鹰管。存放于-80 ° C。
净化
1. 最后的清理，放入含有0.1 M盐酸烧瓶内carboy管
2. 直接管，导致到原始carboy的4L瓶。
3. 开关上的泵和3运行，通过运行在原有carboy收集流。
4. 最后，灭菌水冲洗管。

代表性的成果：由两个Sterivix每个过滤器在0.22μm的和2.7μm的尺寸范围从大约10大号海水中含有微生物生物量的最终结果。这是存储在DNA提取裂解液和准备。此外，此过程中收集和生物量超过2.7微米的，专注于GF / D转换预过滤器。这也是存储在DNA提取裂解液和准备。如果采取额外的处理步骤，流过的0.22微米可以集中收集病毒分数以及。

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Discussion

当务之急是盐水中删除任何挥之不去的痕迹，否则将腐蚀设备后，使用湿毛巾擦拭长椅和泵。虽然过程很简单，时间要求，可广泛取决于生物质的浓度或在被筛选的样本碎片。

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Acknowledgments

我们要感谢支持沿海和公海水域低氧气地区正在进行的研究创新，不列颠哥伦比亚省知识发展基金和国家科学和工程研究理事会（NSERC），加拿大的加拿大基金会。提高妇女地位司的支持由NSERC，Killam和图拉基金会资助的微生物多样性和进化中心奖学金。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic pump		Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing		Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	For filtration apparatus
Hose clamps		Cole-Parmer	0683204	For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors		Cole-Parmer	31702-20	For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing		ADVANTEC	501200	For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock)		Cole-Parmer	31507-27	For filtration apparatus
2“ Magnets			For filtration apparatus
3 port carboy caps				For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters		EMD Millipore	SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters		Whatman, GE Healthcare	1823047
Lysis buffer	Reagent			0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl	Reagent			For post-filtration rinse
Autoclaved water	Reagent			For post-filtration rinse