Grote Volume (20L +) Filtratie van Coastal Zeewater Monsters

Summary

Deze video documenten groot volume (≥ 20 L) filtratie van microbiële biomassa, variërend van 0.22μm en 2.7μm in diameter, uit het water kolom.

Abstract

De workflow begint met het verzamelen van de kust mariene wateren voor de downstream microbiële gemeenschap, nutriënten-en trace gas analyses. Voor deze methode werden monsters verzameld vanaf het dek van de HMS John Strickland die actief zijn in Saanich Inlet. Deze video documenten groot volume (≥ 20 L) filtratie van microbiële biomassa, variërend van 0.22μm en 2.7μm in diameter, uit het water kolom. Twee 20L monsters kunnen gelijktijdig worden gefilterd met een enkele pomp unit uitgerust met vier draaibare koppen. Filtratie is gedaan in het veld op lange reizen, of direct bij terugkeer voor dagtochten. Het is belangrijk om op te nemen van de hoeveelheid water die door elke sterivex filter unit. Om te voorkomen dat biofilmvorming tussen de monsterneming reizen, moeten alle filtratie-apparatuur worden gespoeld met verdund HCl en gedeïoniseerd water en geautoclaveerd onmiddellijk na gebruik. Deze procedure duurt ongeveer 5 uur, plus een extra uur voor het opruimen.

Protocol

1. Opzetten van filtratie apparatuur
   1. Voor het instellen van het filtreerapparaat, gebruik een pincet in een klasse GF / D-filter te plaatsen in het voorfilter wooneenheid. Losjes vast de behuizing met de hand. Als een vuistregel, niet te strak of het apparaat zal lekken zodra de pompen begint.
   2. Vervang de mandfles dop met de geautoclaveerde dop en de bijgevoegde slang door zorgvuldig het inbrengen van de interne slang in de mandfles, zonder aan te raken. Gebruik indien nodig een pincet om de slang te begeleiden in de mandfles.
   3. Passeren van de externe slang door de peristaltische pomp.
   4. Bevestig voorfilter woningen aan het einde van zowel de externe buizen (dat wil zeggen twee eenheden per mandfles). Draai de verbinding met een tang.
2. Filtratie van zeewater
   1. Om te beginnen filteren het zeewater, zet de pomp aan en zet de stroomsnelheid op 1. Kijken om ervoor te zorgen dat het water wordt gepompt in de juiste richting.
   2. Laat 500 ml water vrij stromen door het voorfilter unit en in een bekerglas van 1 liter.
   3. Schakel de pomp, en sluit een Sterivex filter om de mannelijke luer fitting aan het vrije uiteinde van de voorfilter setup. Draai de voorfilter behuizing precies met de hand.
   4. Kijk uit voor de voorfilter behuizing en aan de verbinding tussen de voorfilter behuizing en de slang die leidt naar de mandfles. Als er lekken optreden, schakelt u de pomp uit en los te maken en dus draai het voorfilter behuizing. Schakel de pomp weer aan.
   5. Verzamel het filtraat in 4 L kolven. Zodra ze zijn vol, leeg de kolven in een schone mandfles. Zorg ervoor dat het volume doorgegeven door elk filter noot. Verzamelde filtraat kan verder worden verwerkt, zoals filtratie op virussen.
   6. Ga verder filteren tot er geen water meer in de jerrycans. De gebruikelijke filtratie tijden variëren tussen 4-5 uur / 20 L mandfles, maar dit is afhankelijk drastisch af van de hoeveelheid biomassa in het water.
   7. Zodra filtratie is voltooid, schakelt de pomp uit en ontkoppel de Sterivex filters.
3. Opslag van filters
   1. Voor het opslaan van de filters, eerst te verdrijven resterende water met een 30-60 ml spuit.
   2. Met behulp van een pipet, voeg 1.8ml lysis buffer om het filter, het houden van ~ 200 ul van de ruimte in het filter voor de latere toevoeging van de reagentia.
   3. Sluit de onderkant en bovenkant van de Sterivex filter met een klein stukje Parafilm, en label de filters met de datum en monster identificatie.
   4. Bewaar de filters in een pre-gelabeld 50 ml falcon buis bij -80 ° C
   5. Haal de filters uit de wooneenheid en plaats ze in gelabelde 50 ml Falcon buizen met 2 ml lysis buffer. Bewaar deze bij -80 ° C.
4. Schoonmaken
   1. Voor de eindschoonmaak, plaats de slang, dat was in de mandfles in een kolf met 0,1 M HCl
   2. Direct de slang die naar de 4L fles te leiden naar de oorspronkelijke mandfles.
   3. Schakel de pomp en draaien op 3, het verzamelen van de stroom door lopen in de originele mandfles.
   4. Spoel ten slotte de buis met geautoclaveerd water.

Vertegenwoordiger Resultaten: Het uiteindelijke resultaat bestaat uit twee Sterivix filters elk microbiële biomassa van circa 10 L zeewater in de orde van grootte van 0.22μm en 2.7μm. Dit wordt opgeslagen in lysis buffer en klaar voor DNA-extractie. Daarnaast is deze procedure verzamelt en concentreert zich biomassa groter dan 2,7 micrometer, op de GF / D voorfilters. Dit is ook opgeslagen in lysis buffer en klaar voor DNA-extractie. Als er extra verwerking maatregelen worden genomen, kan de 0,22 uM doorstroming worden geconcentreerd naar de virale fractie te verzamelen ook.

Discussion

Het is noodzakelijk om te vegen van banken en pompen met een vochtige handdoek na gebruik aan een slepende sporen van zout water die anders zouden aantasten apparatuur te verwijderen. Hoewel de procedure is eenvoudig, kan de benodigde tijd uitgebreid worden afhankelijk van de concentratie van biomassa of afval in het monster wordt gefilterd.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic pump		Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing		Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	For filtration apparatus
Hose clamps		Cole-Parmer	0683204	For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors		Cole-Parmer	31702-20	For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing		ADVANTEC	501200	For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock)		Cole-Parmer	31507-27	For filtration apparatus
2“ Magnets			For filtration apparatus
3 port carboy caps				For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters		EMD Millipore	SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters		Whatman, GE Healthcare	1823047
Lysis buffer	Reagent			0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl	Reagent			For post-filtration rinse
Autoclaved water	Reagent			For post-filtration rinse