Biology

बड़ी मात्रा में (20L +) तटीय समुद्र के पानी के नमूने की निस्पंदन

Published: June 18, 2009 doi: 10.3791/1161

David A. Walsh¹, Elena Zaikova¹, Steven J. Hallam¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

Summary

यह वीडियो दस्तावेजों माइक्रोबियल बायोमास के बड़ी मात्रा निस्पंदन (≥ 20 एल), 0.22μm और व्यास में 2.7μm के बीच लेकर पानी के स्तंभ से.

Abstract

वर्कफ़्लो बहाव माइक्रोबियल समुदाय के लिए तटीय समुद्री जल, पोषक तत्व और ट्रेस गैस विश्लेषण के संग्रह के साथ शुरू होता है. इस विधि के लिए, नमूने Saanich Inlet में एचएमएस जॉन Strickland के संचालन के डेक से एकत्र किए गए थे. यह वीडियो दस्तावेजों माइक्रोबियल बायोमास के बड़ी मात्रा निस्पंदन (≥ 20 एल), 0.22μm और व्यास में 2.7μm के बीच लेकर पानी के स्तंभ से. दो 20L नमूने एक साथ फ़िल्टर्ड किया जा सकता है एक एकल पंप चार घूर्णन सिर के साथ सुसज्जित इकाई का उपयोग कर. निस्पंदन विस्तारित दौरे पर क्षेत्र में किया जाता है, या दिन के दौरे के लिए तुरंत वापसी पर. यह महत्वपूर्ण है के लिए पानी की मात्रा प्रत्येक sterivex फिल्टर यूनिट के माध्यम से गुजर रिकॉर्ड. नमूने यात्राओं के बीच biofilm गठन को रोकने के सभी निस्पंदन उपकरण पतला एचसीएल और विआयनीकृत जल के साथ rinsed होना चाहिए और उपयोग के बाद तुरंत autoclaved. यह प्रक्रिया लगभग 5 घंटे से अधिक साफ अप के लिए एक अतिरिक्त घंटे ले जाएगा.

Protocol

निस्पंदन तंत्र के सेट अप
1. निस्पंदन उपकरण सेट करने के लिए, चिमटी का उपयोग prefilter आवास की इकाई में एक ग्रेड / GF डी फिल्टर जगह. शिथिल हाथ से आवास कस लें. अंगूठे का एक नियम के रूप में, या नहीं से अधिक - कस यूनिट पम्पिंग शुरू होता है एक बार लीक करेंगे.
2. ध्यान से काबोइ में इसे छू बिना आंतरिक टयूबिंग डालने autoclaved टोपी और संलग्न टयूबिंग के साथ काबोइ टोपी बदलें. यदि आवश्यक हो, चिमटी का उपयोग काबोइ में टयूबिंग गाइड.
3. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के माध्यम से बाहरी टयूबिंग दर्रा.
4. Prefilter आवासीय इकाइयों दोनों बाहरी ट्यूब (यानी काबोइ प्रति 2 इकाइयों) के अंत करने के लिए संलग्न. सरौता के साथ कनेक्शन कस.
समुद्री जल निस्पंदन
1. समुद्री जल को छानने शुरू करने के लिए, पंप पर बारी है और 1 के लिए प्रवाह की गति सेट. सुनिश्चित करें कि उचित दिशा में पानी पंप किया जा रहा है देखो.
2. पानी की 500 मिलीलीटर prefilter इकाई के माध्यम से और एक 1 एल बीकर में स्वतंत्र रूप से प्रवाह के लिए अनुमति दें.
3. बंद पंप चालू करें, और पुरुष luer फिटिंग के लिए prefilter सेटअप के मुक्त अंत में एक Sterivex फिल्टर संलग्न. हाथ से prefilter आवास snugly कस.
4. Prefilter आवास और prefilter आवास और टयूबिंग कि काबोइ की ओर जाता है है के बीच कनेक्शन पर के लिए देखो. यदि लीक होते हैं, पंप बंद और ढीला और तदनुसार prefilter आवास retighten. पंप पर वापस मुड़ें.
5. 4 एल बोतल में छानना लीजिए. एक बार वे पूरा कर रहे हैं, एक साफ काबोइ में खाली बोतल. प्रत्येक फिल्टर के माध्यम से पारित मात्रा नोट सुनिश्चित करें. एकत्र छानना आगे वायरस के लिए छानने का काम के रूप में प्रसंस्कृत किया जा सकता है.
6. फ़िल्टरिंग जारी रखें जब तक कोई पानी carboys में छोड़ दिया है. 4-5 घंटे / 20 एल काबोइ के बीच हमेशा की तरह निस्पंदन बार रेंज, तथापि, यह नाटकीय रूप से पानी के भीतर बायोमास की राशि पर निर्भर करता है.
7. एक बार छानने का काम पूरा हो गया है, पंप बंद और Sterivex फिल्टर डिस्कनेक्ट.
फिल्टर का भंडारण
1. फिल्टर की दुकान करने के लिए, पहले एक 30-60 मिलीलीटर सिरिंज के साथ किसी भी शेष पानी को निष्कासित.
2. एक विंदुक का प्रयोग, फिल्टर करने के लिए 1.8ml lysis बफर जोड़ने के लिए अभिकर्मकों के बाद इसके अलावा के लिए फिल्टर में ~ अंतरिक्ष के 200 उल रखने.
3. Parafilm का एक छोटा सा टुकड़ा के साथ और Sterivex फिल्टर के नीचे और ऊपर सील, और दिनांक और नमूना पहचान के साथ फिल्टर लेबल.
4. स्टोर एक पूर्व लेबल 50 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब में फिल्टर -80 पर डिग्री सेल्सियस
5. आवास की इकाई से फिल्टर निकालें और उन्हें लेबल 50 मिलीलीटर फाल्कन lysis बफर के 2 मिलीलीटर युक्त ट्यूबों में जगह. -80 पर इन स्टोर डिग्री सेल्सियस
सफाई
1. अंतिम सफाई के लिए, एक 0.1 एम एचसीएल युक्त कुप्पी में टयूबिंग है कि काबोइ अंदर था जगह
2. टयूबिंग है कि मूल काबोइ में 4L फ्लास्क के लिए नेतृत्व प्रत्यक्ष.
3. पंप पर स्विच और 3 पर चलाने के लिए, रन के माध्यम से मूल काबोइ में प्रवाह इकट्ठा.
4. अंत में, autoclaved पानी के साथ टयूबिंग कुल्ला.

प्रतिनिधि परिणाम: अंतिम परिणाम Sterivix दो माइक्रोबियल बायोमास 0.22μm और 2.7μm के आकार की सीमा में लगभग 10 एल समुद्री जल से युक्त प्रत्येक फिल्टर के होते हैं . यह lysis बफर में संग्रहीत है और डीएनए निष्कर्षण के लिए तैयार है. इसके अलावा, इस प्रक्रिया इकट्ठा और 2.7 सुक्ष्ममापी की तुलना में अधिक बायोमास GF / डी prefilters ध्यान केंद्रित है. यह भी lysis बफर में संग्रहीत किया जाता है और डीएनए निष्कर्षण के लिए तैयार है. यदि अतिरिक्त संसाधन कदम उठाए हैं, 0.22 प्रवाह के माध्यम से सुक्ष्ममापी नीचे ध्यान केंद्रित किया वायरल अंश के रूप में अच्छी तरह से इकट्ठा कर सकते हैं.

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Discussion

यह उपयोग करने के लिए नमक पानी के किसी भी सुस्त निशान है कि अन्यथा उपकरण खुरचना होगा निकालने के बाद एक नम तौलिया के साथ सत्ता पक्ष और पंप करने के लिए नीचे पोंछ जरूरी है. हालांकि प्रक्रिया सरल है, समय की आवश्यकता है या फ़िल्टर्ड किया जा रहा नमूना में बायोमास मलबे की एकाग्रता के आधार पर व्यापक किया जा सकता है है.

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Acknowledgments

हम तटीय और खुले समुद्र के पानी के कम ऑक्सीजन क्षेत्रों पर चल रहे अध्ययन का समर्थन करने के लिए अभिनव, ब्रिटिश कोलंबिया नॉलेज डेवलपमेंट फंड और राष्ट्रीय विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल () NSERC के लिए कनाडा फाउंडेशन धन्यवाद देना चाहूंगा. काला कौवा NSERC, किल्लम और तुला माइक्रोबियल विविधता और विकास के लिए वित्त पोषित केंद्र नींव से फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic pump		Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing		Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	For filtration apparatus
Hose clamps		Cole-Parmer	0683204	For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors		Cole-Parmer	31702-20	For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing		ADVANTEC	501200	For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock)		Cole-Parmer	31507-27	For filtration apparatus
2“ Magnets			For filtration apparatus
3 port carboy caps				For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters		EMD Millipore	SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters		Whatman, GE Healthcare	1823047
Lysis buffer	Reagent			0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl	Reagent			For post-filtration rinse
Autoclaved water	Reagent			For post-filtration rinse