Biology

Stor volym (20L +) Filtrering av Coastal Havsvatten Prover

Published: June 18, 2009 doi: 10.3791/1161

David A. Walsh¹, Elena Zaikova¹, Steven J. Hallam¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

Summary

Denna video dokument stor volym (≥ 20 L) filtrering av mikrobiella biomassan, mellan 0.22μm och 2.7μm i diameter, ur vattnet.

Abstract

Arbetsflödet börjar med insamling av kustnära marina vatten för nedströms mikrobiella, närings-och spårgas analyser. För denna metod har prover som tagits från däcket på HMS John Strickland verksamma i Saanich Inlet. Denna video dokument stor volym (≥ 20 L) filtrering av mikrobiella biomassan, mellan 0.22μm och 2.7μm i diameter, ur vattnet. Två 20L prover kan filtreras samtidigt med en enda pump utrustad med fyra roterande huvuden. Filtreringen sker i fältet på förlängda resor eller omedelbart efter avkastning för dagsutflykter. Det är viktigt att registrera den mängd vatten som passerar genom varje sterivex filter. För att förhindra att biofilm bildas mellan provtagning resor måste all utrustning för filtrering sköljas med utspädd HCl och avjoniserat vatten och autoklaveras direkt efter användning. Denna procedur tar cirka 5 timmar plus en extra timme för sanering.

Protocol

Sätt upp av filtreringsapparaten
1. För att ställa in filtreringsapparaten använder pincett för att placera en klass GF / D-filtret i förfilter bostadshuset. Dra åt huset för hand. Som en tumregel, inte åt för hårt eller enheten kommer att läcka när pumpningen börjar.
2. Byt Damejeanne locket med autoklaveras locket och fäst slangen genom att försiktigt föra den interna slangen i Damejeanne utan att röra den. Om det behövs använder pincett för att styra slangen i Damejeanne.
3. Passera den externa slangen genom peristaltiska pumpen.
4. Montera förfiltret bostäder till slutet av både yttre rör (dvs 2 enheter per Damejeanne). Dra åt anslutningen med en tång.
Filtrering av havsvatten
1. Till att börja filtrera havsvatten, slå på pumpen och ställ in flödet hastigheten till 1. Se till att vatten pumpas i rätt riktning.
2. Låt 500 ml vatten att flöda fritt genom förfiltret enheten och till en 1 L bägare.
3. Stäng av pumpen och bifoga en Sterivex filter för att den manliga luer montering vid fria änden av förfilter installationen. Dra åt tätt förfilter bostäder för hand.
4. Håll utkik efter på förfilter bostäder och på sambandet mellan förfilter bostäder och slangen som leder till Damejeanne. Om läckage inträffar, stäng av pumpen och lossa och dra åt förfiltret boende därefter. Slå på pumpen igen.
5. Samla upp filtratet i 4 L flaskor. När de är fullastade, tomma kolvarna i en ren Damejeanne. Var noga med att notera mängden passerar genom varje filter. Insamlade filtratet kan bearbetas vidare, såsom filtrering efter virus.
6. Fortsätt filtreringen tills inget vatten kvar i dunkar. Vanlig filtrering gånger varierar mellan 4-5 tim / 20 L Damejeanne, men detta beror dramatiskt på hur mycket biomassa i vattnet.
7. När filtreringen är klar, stänger av pumpen och koppla bort Sterivex filter.
Lagring av filter
1. För att lagra filter, först utesluta eventuellt kvarvarande vatten med en 30-60 ml spruta.
2. Med hjälp av en pipett, tillsätt 1.8ml lyseringsbuffert till filtret, hålla ~ 200 ul av utrymme i filtret för senare tillsats av reagenser.
3. Täta botten och toppen av Sterivex filtret med en liten bit Parafilm och etikett filtren med datum och prov identifiering.
4. Förvara filtren i en pre-märkt 50 ml Falcon rör vid -80 ° C
5. Ta bort filtren från bostaden och placera dem i märkta 50 ml Falcon rör som innehåller 2 ml lyseringsbuffert. Förvara dessa på -80 ° C.
Cleanup
1. För slutlig rengöring, placera slangen som var inne i Damejeanne i en kolv innehållande 0,1 M HCl
2. Direkt slangen som leder till 4L kolven till det ursprungliga Damejeanne.
3. Slå på pumpen och kör på 3, samla flödet genom springa i den ursprungliga Damejeanne.
4. Slutligen, skölj slangen med autoklaveras vatten.

Representativa resultat: Det slutliga resultatet består av två Sterivix filter som vardera innehåller mikrobiella biomassan från ca 10 L havsvatten i storleksordningen 0.22μm och 2.7μm. Detta lagras i lyseringsbuffert och redo för DNA-extraktion. Dessutom samlar den här proceduren och koncentrat biomassa är större än 2,7 ìm, på GF / D förfilter. Detta är också lagras i lyseringsbuffert och redo för DNA-extraktion. Om ytterligare behandling åtgärder vidtas, kan 0,22 mikroM genomströmning koncentreras ner för att samla den virala bråkdel också.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det är viktigt att torka av bänkar och pumpar med en fuktig handduk efter användning för att ta bort eventuella kvardröjande spår av salt vatten som annars skulle korrodera utrustning. Även om förfarandet är enkelt, kan den tid som kravet omfattande beroende på koncentrationen av biomassa eller skräp i provet filtreras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi vill tacka det kanadensiska institutet för innovation, British Columbia Kunskap utvecklingsfonden och Statens Sciences and Engineering Research Council (NSERC) i Kanada för att stödja pågående studier på låg syre regioner i kustnära och öppna hav vatten. DAW stöddes av stipendier från NSERC, Killam och Tula stiftelsen finansierade Centrum för Mikrobiell diversitet och evolution.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic pump		Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing		Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	For filtration apparatus
Hose clamps		Cole-Parmer	0683204	For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors		Cole-Parmer	31702-20	For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing		ADVANTEC	501200	For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock)		Cole-Parmer	31507-27	For filtration apparatus
2“ Magnets			For filtration apparatus
3 port carboy caps				For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters		EMD Millipore	SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters		Whatman, GE Healthcare	1823047
Lysis buffer	Reagent			0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl	Reagent			For post-filtration rinse
Autoclaved water	Reagent			For post-filtration rinse