Biology

Grand volume (20L +) filtration d'échantillons d'eau de mer côtière

Published: June 18, 2009 doi: 10.3791/1161

David A. Walsh¹, Elena Zaikova¹, Steven J. Hallam¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

Summary

Ce volume de gros documents vidéo (≥ 20 L) de filtration de la biomasse microbienne, variant entre 0.22μm et 2.7μm de diamètre, à partir de la colonne d'eau.

Abstract

Le flux de travail commence avec la collecte des eaux marines côtières pour la communauté microbienne en aval, des analyses des éléments nutritifs et de gaz de trace. Pour cette méthode, des échantillons ont été collectés depuis le pont de l'exploitation du HMS John Strickland dans l'inlet Saanich. Ce volume de gros documents vidéo (≥ 20 L) de filtration de la biomasse microbienne, variant entre 0.22μm et 2.7μm de diamètre, à partir de la colonne d'eau. Deux échantillons 20L peuvent être filtrés en utilisant simultanément une unité unique pompe équipée de quatre têtes rotatives. La filtration est effectuée dans le domaine des voyages prolongés, ou immédiatement après le retour des excursions d'une journée. Il est important d'enregistrer la quantité d'eau passant à travers chaque unité sterivex filtre. Pour prévenir la formation de biofilm entre les voyages d'échantillonnage, tous les équipements de filtration doit être rincée avec de l'HCl dilué et de l'eau déminéralisée et autoclavées immédiatement après usage. Cette procédure prendra environ 5 heures plus une heure supplémentaire pour le nettoyage.

Protocol

Mise en place d'un appareil de filtration
1. Pour configurer l'appareil de filtration, utilisez une pince à épiler pour placer une note GF / D filtre dans le logement préfiltre. Librement serrer les logements à la main. En règle générale, ne pas serrer trop fort ou l'appareil une fois la fuite commence à pomper.
2. Remplacer le bouchon bonbonnes avec le bouchon à l'autoclave et tube attaché par attentivement insérant le tube interne dans la tourie sans le toucher. Si nécessaire, utilisez une pince à épiler pour guider le tube dans la tourie.
3. Passez le tube externe via la pompe péristaltique.
4. Fixez logements préfiltre à la fin des deux tubes extérieurs (soit 2 unités par bonbonne de). Serrer la connexion avec une pince.
Filtration de l'eau de mer
1. Pour commencer le filtrage de l'eau de mer, tourner sur la pompe et régler la vitesse d'écoulement à 1. Regarder pour s'assurer que l'eau est pompée dans la bonne direction.
2. Autoriser 500 ml d'eau de circuler librement à travers l'unité de pré-filtre et dans un bécher de 1 L.
3. Eteignez la pompe, et joindre un filtre Sterivex au raccord Luer mâle à l'extrémité libre de la configuration préfiltre. Serrez les logements confortablement préfiltre à la main.
4. Surveillez sur le boîtier préfiltre et à la connexion entre le boîtier préfiltre et le tuyau qui mène à la bonbonne. Si les fuites se produisent, arrêtez la pompe et desserrer et resserrer les logements préfiltre en conséquence. Tourner le dos à la pompe.
5. Recueillir le filtrat dans quatre flacons L. Une fois qu'ils sont pleins, vider les flacons dans une tourie propre. N'oubliez pas de noter le volume transmis à travers chaque filtre. Recueillies filtrat peut être traité, comme la filtration des virus.
6. Continuez jusqu'à ce filtrage sans eau est laissé dans les bonbonnes. Usual filtration fois comprise entre 4-5 h / 20 bonbonnes L; toutefois, cela dépend énormément de la quantité de biomasse dans l'eau.
7. Une fois la filtration terminée, passer la pompe hors tension et débranchez les filtres Sterivex.
Stockage des filtres
1. Pour stocker les filtres, tout d'abord expulser toute l'eau restante avec une seringue 30-60 ml.
2. Avec une pipette, ajouter 1,8 ml de tampon de lyse dans le filtre, en gardant ~ 200 ul d'espace dans le filtre pour plus tard des réactifs.
3. Sceller le bas et le haut du filtre Sterivex avec un petit morceau de parafilm, et étiqueter les filtres avec la date et l'identification de l'échantillon.
4. Stocker les filtres dans un tube pré-étiquetés Falcon de 50 ml à -80 ° C
5. Retirer les filtres de l'unité de logement et les placer dans des tubes Falcon 50 étiquetés ml contenant 2 ml de tampon de lyse. Stocker ces à -80 ° C.
Nettoyage
1. Pour le nettoyage final, place le tuyau qui était à l'intérieur de la tourie dans un flacon contenant 0,1 M de HCl
2. Diriger le tube qui conduisent à la fiole 4L dans la tourie d'origine.
3. Allumer la pompe et tourner à 3, la collecte de l'écoulement à travers lancer dans la tourie d'origine.
4. Enfin, rincer la tubulure avec de l'eau en autoclave.

Les résultats représentatifs: Le résultat final est constitué de filtres Sterivix deux chacun contenant la biomasse microbienne d'environ 10 L d'eau de mer dans la plage de taille de 0.22μm et 2.7μm. Il est stocké dans un tampon de lyse et prêt pour l'extraction de l'ADN. En outre, cette procédure recueille et concentre la biomasse supérieure à 2,7 um, sur les préfiltres GF / D. Ce sont également stockées dans un tampon de lyse et prêt pour l'extraction de l'ADN. Si les étapes de traitement supplémentaires sont prises, l'0,22 uM accréditives peuvent être concentrés vers le bas pour recueillir la fraction virale ainsi.

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Discussion

Il est impératif d'essuyer les bancs et les pompes avec une serviette humide après utilisation afin d'éliminer toute trace persistante d'eau salée qui, autrement, se corrodent équipement. Bien que la procédure est simple, l'exigence de temps peut être étendue en fonction de la concentration de la biomasse ou de débris dans l'échantillon filtré.

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Acknowledgments

Nous tenons à remercier la Fondation canadienne pour l'innovation, le Fonds de développement des connaissances en Colombie-Britannique et les sciences naturelles et en génie (CRSNG) du Canada pour soutenir les études en cours sur les régions pauvres en oxygène des eaux côtières et océaniques ouverts. DAW a été soutenu par des bourses du CRSNG, la Fondation Killam et TULA Centre a financé pour la diversité microbienne et évolution.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic pump		Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing		Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	For filtration apparatus
Hose clamps		Cole-Parmer	0683204	For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors		Cole-Parmer	31702-20	For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing		ADVANTEC	501200	For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock)		Cole-Parmer	31507-27	For filtration apparatus
2“ Magnets			For filtration apparatus
3 port carboy caps				For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters		EMD Millipore	SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters		Whatman, GE Healthcare	1823047
Lysis buffer	Reagent			0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl	Reagent			For post-filtration rinse
Autoclaved water	Reagent			For post-filtration rinse