Biology

حجم صغير (1 - 3L) الترشيح للعينات مياه البحر الساحلية

Published: June 19, 2009 doi: 10.3791/1163

David A. Walsh¹, Elena Zaikova¹, Steven J. Hallam¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

Summary

هذا الكتاب وثائق فيديو صغيرة (~ 1 L) ترشيح الكتلة الحيوية الميكروبية من عمود الماء.

Abstract

يبدأ سير العمل في جمع المياه البحرية الساحلية للمجتمع الميكروبية المصب ، ويحلل الغاز المغذيات والتتبع. مظاهرة اليوم للحصول على عينات ليالي جمعت من على متن سفينتى التشغيل جون ستريكلاند في مدخل Saanich. هذا الكتاب وثائق فيديو صغيرة (~ 1 L) ترشيح الكتلة الحيوية الميكروبية من عمود الماء. البروتوكول هو امتداد لأخذ العينات حجم كبير بروتوكول صفت في وقت سابق ، مع فارق واحد رئيسي : هنا ، لا يوجد أي خطوة قبل الترشيح ، بحيث يتم جمع كل الفئات حجم الكتلة الحيوية وصولا الى 0.22 ميكرون تصفية الوقف. جمع عينات من هذه الطريقة مثالية لتحليل الحمض النووي. خطوات انشاء ، والترشيح ، وتنظيف كل يستغرق حوالي 20-30 دقيقة. إذا به قد مضختين تمعجية وقت واحد ، لتتم تصفيته حتى 8 عينات في نفس الوقت. لمنع تشكيل بيوفيلم رحلات بين أخذ العينات ، يجب شطف جميع المعدات الترشيح مع حمض الهيدروكلوريك المخفف والمياه وتعقيمها منزوع الأيونات بعد الاستعمال مباشرة.

Protocol

مجموعة تتكون من أجهزة الترشيح
1. قبل الترشيح ، ويمسح الأولى بعيدا من أي التكثيف الزجاجات كاملة وتزن لهم
2. وضع علامة بن الأوتوكلاف على جانب واحد من المضخة ، وقارورة النفايات من جهة أخرى.
3. ثم ضع زجاجة عينة كاملة في بن الأوتوكلاف ، ومع ذلك ، لا تقم بإزالة الغطاء من القمقم بعد.
4. تمرير أنابيب من خلال مضخة تمعجية بحيث نهاية luer من الأنابيب في القارورة.
5. باستخدام الملقط ، إزالة القطن من ماصة معقمة 25 مل ، وإرفاق ماصة إلى الطرف الآخر من الأنبوب.
ترشيح مياه البحر
1. لتبدأ تصفية مياه البحر ، وفتح زجاجة وإدراج ماصة. تشغيل المضخة وضبط سرعة تدفق إلى 1. رايتس ووتش إلى ضمان أن المياه التي يتم ضخها في الاتجاه الصحيح.
2. سماح ~ 100 مليلتر من الماء بالمرور عبر الأنابيب بأكمله.
3. إيقاف ضخ وتصفية إرفاق Sterivex لتركيب luer الذكور في نهاية الحرة للأنابيب.
4. يستمر الترشيح حتى لا يترك الماء في زجاجات.
تخزين الفلاتر
1. لتخزين المرشحات ، وطرد الأولى أي المياه المتبقية مع حقنة مل 30-60.
2. ختم الجزء السفلي من تصفية Sterivex مع Parafilm. باستخدام ماصة ، إضافة 1.8ml العازلة تحلل إلى تصفية ، وحفظ ~ 200 UL الفضاء في تصفية بالإضافة إلى وقت لاحق من الكواشف.
3. ثم ختم الجزء العلوي من تصفية Sterivex مع قطعة صغيرة من Parafilm ، وتسمية المرشحات مع التاريخ وتحديد العينة.
4. تخزين المرشحات في مرحلة ما قبل المسمى أنابيب الصقر 50 مل في -80 درجة مئوية
تنظيف
1. إدراج ماصة 25 مل في القارورة التي تحتوي على حمض الهيدروكلوريك 0.1 ٪ ، والتبديل في المضخة.
2. بعد غسل حمض الهيدروكلوريك ، شطف الأنابيب بالماء تعقيمها.
  
  أخيرا ، وقياس وتسجيل كتلة من الزجاجات الفارغة في 1L الآن من أجل حساب حجم المياه تمر عبر الفلتر.

نتائج ممثل : كل المياه 1 لتر عينة غلة one Sterivix التصفية ، الذي يحتوي على الكتلة أكبر من 0.22 ميكرون. يتم تخزين هذه العازلة في تحلل لاستخراج الحمض النووي وتحليل لاحقة. النتيجة النهائية يتكون من مرشح واحد لكل Sterivix 1 ليتر المخزنة في زجاجة عازلة تحلل وعلى استعداد لاستخراج الحمض النووي. مرشح الكتلة الحيوية تحتوي أكبر من 0.22 ميكرون. ويمكن تخزين المرشحات في -80 درجة مئوية قبل EDNA الاستخراج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ومن الضروري أن يمسح أسفل المقاعد ومضخات بمنشفة مبللة بعد الاستخدام لإزالة أي آثار متبقية من المياه المالحة التي من شأنها أن خلاف ذلك تآكل المعدات. على الرغم من أن هذا الإجراء هو بسيط ، يمكن أن تكون واسعة شرط الوقت اعتمادا على تركيز الكتلة الحيوية أو الحطام في العينة التي تمت تصفيتها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نود أن نشكر المؤسسة الكندية للإبداع ، ومعارف كولومبيا البريطانية وصندوق التنمية الوطنية للعلوم والهندسة مجلس البحوث (NSERC) من كندا لدعم الدراسات الجارية على المناطق المنخفضة من الأوكسجين مياه المحيطات والمناطق الساحلية المفتوحة. كان مدعوما من قبل شعبة النهوض بالمرأة من الزمالات NSERC ، Killam ومؤسسة التمويل مركز تولا للتنوع وتطور الميكروبية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic pump	Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing	Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	For filtration apparatus
Hose clamps	Cole-Parmer	0683204	For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors	Cole-Parmer	31702-20	For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing	ADVANTEC	501200	For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock)	Cole-Parmer	31507-27	For filtration apparatus
2“ Magnets			For filtration apparatus
3 port carboy caps			For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters	EMD Millipore	SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters	Whatman, GE Healthcare	1823047
Lysis buffer			0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl			For post-filtration rinse
Autoclaved water			For post-filtration rinse