Biology

연안 해수 샘플을 소량 (1 - 3L)은 여과

Published: June 19, 2009 doi: 10.3791/1163

David A. Walsh¹, Elena Zaikova¹, Steven J. Hallam¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

Summary

이 동영상은 문서 소량 (~ 1 L) 물 기둥에서 미생물 바이오 매스의 여과.

Abstract

흐름은 하류 미생물 커뮤니티 해안 해양 물, 영양 및 추적 가스 분석의 수집과 함께 시작됩니다. 오늘의 데모 샘플 사니치 후미에 HMS 존 스트 리클 랜드 운영의 갑판에서 수집되었다. 이 동영상은 문서 소량 (~ 1 L) 물 기둥에서 미생물 바이오 매스의 여과. 바이오 매스의 크기 수업 컷 - 오프 필터 0.22 μm의 아래로 수집하므로, 여기에는 사전에 여과 단계가 없습니다 : 프로토콜은 큰 볼륨 샘플링 프로토콜 하나의 큰 차이와, 앞에서 설명한의 확장 기능입니다. 샘플 핵산 분석에 이상적입니다 이런 방식을 수집했습니다. 설정, 여과 및 정리 단계는 각 20~30분 정도 걸릴. 8 최대 샘플은 동시에 필터링 수, 동시에 두 연동 펌프를 사용하는 경우. 샘플링 여행 사이의 biofilm 형성을 방지하기 위해, 모든 여과 장비는 희석 HCL 및 탈이온수로 씻어서 바로 사용 후 autoclaved해야합니다.

Protocol

여과 장치의 설정
1. 필터링하기 전에 먼저 전체 병으로부터 응축을 닦아 그것을 달다
2. 다른에있는 펌프의 한쪽 압력솥 빈, 그리고 폐기물 플라스크를 놓습니다.
3. 다음 압력솥 빈의 전체 샘플 병을 배치하지만, 아직 병 뚜껑을 제거하지 마십시오.
4. 튜빙의 luer 끝이 술병에 수 있도록 연동 펌프를 통해 튜빙을 전달합니다.
5. 핀셋을 사용하여 살균 25 ML의 피펫에서 목화를 제거하고, 튜브의 다른 끝에 피펫을 첨부합니다.
해수 여과
1. 해수를 필터링 시작하려면 용기를 열고 피펫을 삽입합니다. 펌프의 전원을 켜고 1 흐름 속도를 설정할 수 있습니다. 물이가 올바른 방향으로 나오지되도록보세요.
2. 물 ~ 100 ML은 전체 튜브 통과하도록 허용합니다.
3. 펌프를 끄고 튜브의 자유로운 끝에 남자 luer 피팅에 Sterivex 필터를 첨부합니다.
4. 어떤 물이 병에 남아되지 않습니다 때까지 계속 필터링.
필터 저장
1. 필터를 저장하려면 먼저 30-60 ML의 주사기와 함께 남아있는 물을 추방.
2. Parafilm와 Sterivex 필터의 바닥을 봉쇄해. 피펫을 사용하여 시약의 저장뿐만 아니라를 위해 필터의 공간 ~ 200 UL을 유지, 필터 1.8ml 용해 버퍼를 추가합니다.
3. 그런 다음, Parafilm의 작은 조각으로 Sterivex 필터의 상단을 밀봉하고, 날짜와 샘플 식별과 필터를 라벨.
4. -80에 사전 라벨 50 ML 팔콘 튜브에 필터를 저장 ° C
정리
1. 0.1 % HCL을 포함하는 플라스크에 25 ML의 피펫을 삽입하고, 펌프를 전환합니다.
2. HCL 세척 후, autoclaved 물을 튜빙을 씻어.
  
  마지막으로, 측정 및 필터를 통과 물의 볼륨을 계산하기 위해 지금 빈 1L 병의 질량을 기록합니다.

대표 결과 : 각 1 L의 물 샘플은 0.22 μm의보다 큰 바이오 매스를 포함 한 Sterivix 필터를 산출. 이것은 이후 DNA 추출 및 분석을위한 용해 버퍼에 저장됩니다. 최종 결과 한 Sterivix의 용해 버퍼에 저장된 1 리터 병 당 필터 및 DNA 추출을위한 준비로 구성되어 있습니다. 필터는 0.22 μm의보다 큰 바이오 매스가 포함되어 있습니다. 필터는 -80 ° C 이전 에드나 추출 속도로 저장할 수 있습니다.

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Discussion

그것은 달리 장비를 부식 것이다 소금물의 느린 흔적을 제거하는 데 사용 후 젖은 수건으로 벤치와 펌프를 닦아 필수적입니다. 절차는 간단하지만, 시간 요구 사항이 필터링되는 예제에서 바이오 매스이나 먼지의 농도에 따라 광범위한 수 있습니다.

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Acknowledgments

우리는 해안과 열린 바다 바닷물의 낮은 산소 지역에 지속적인 연구를 지원하기위한 혁신, 브리티시 컬럼비아 기술 개발 기금과 국립 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC)에 대한 캐나다 재단 감사드립니다. 도스는 NSERC, 킬람와 툴라 기초 미생물 다양성과 진화에 대한 투자 센터에서 장학금으로 지원했다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic pump	Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing	Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	For filtration apparatus
Hose clamps	Cole-Parmer	0683204	For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors	Cole-Parmer	31702-20	For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing	ADVANTEC	501200	For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock)	Cole-Parmer	31507-27	For filtration apparatus
2“ Magnets			For filtration apparatus
3 port carboy caps			For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters	EMD Millipore	SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters	Whatman, GE Healthcare	1823047
Lysis buffer			0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl			For post-filtration rinse
Autoclaved water			For post-filtration rinse