Biology

Kıyı Deniz suyu Örnekleri Küçük Hacim (1-3L) Filtrasyon

Published: June 19, 2009 doi: 10.3791/1163

David A. Walsh¹, Elena Zaikova¹, Steven J. Hallam¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

Summary

Bu video belgeleri küçük hacimli (~ 1 L) su sütunu mikrobiyal biyokütle filtrasyon.

Abstract

İş akışı downstream mikrobiyal topluluk için kıyı deniz sularında, besin ve iz gaz analizleri toplanması ile başlar. Bugün s gösteri örnekleri için Saanich'dan Giriş HMS John Strickland işletim güverte toplanmıştır. Bu video belgeleri küçük hacimli (~ 1 L) su sütunu mikrobiyal biyokütle filtrasyon. Biyokütle tüm boyut sınıfları 0.22 mikron filtre cut-off toplanır, bu nedenle burada, herhangi bir ön filtrasyon adım vardır: protokolü, büyük hacimli örnekleme protokolü önemli bir fark, daha önce açıklanan bir uzantısı. Örnekler bu şekilde toplanan nükleik asit analizi için idealdir. Set-up, filtrasyon, ve temiz adımlarla, her biri 20-30 dakika sürer. 8 örnekleri aynı zamanda filtre olabilir, aynı anda iki peristaltik pompa kullanıyorsanız. Örnekleme gezileri arasında biyofilm oluşumunu önlemek için tüm filtrasyon ekipmanları seyreltik HCl ve deiyonize su ile durulanır ve kullanımdan hemen sonra otoklava olmalıdır.

Protocol

Filtrasyon aparatı ayarlayın
1. Filtreleme önce, herhangi bir yoğunlaşma ilk tam şişelerden uzak silin ve onları tartmak
2. Pompanın bir tarafta diğer tarafta bir otoklav bin, ve atık şişesi koyun.
3. Sonra tam bir örnek otoklav bin şişe yerleştirin; ancak, henüz şişe kapağını çıkarmayın.
4. Boru luer ucundaki balon olduğunu peristaltik pompa ile boru iletin.
5. 25 ml steril bir pipetle cımbız kullanarak, pamuk kaldırmak ve pipet Hortumun diğer ucunu takın.
Deniz suyu filtre
1. Deniz suyu filtreleme başlamak için, şişe ve pipet ekleyin. Pompa açın ve 1 akış hızını ayarlamak. Bu doğru yönde su pompalanan sağlamak için izleyin.
2. ~ 100 ml su tüm boru geçmesine izin verin.
3. Pompa kapatın ve boru ücretsiz sonunda erkek luer uydurma bir Sterivex filtre takmak.
4. Hiç su şişeleri kalana kadar filtreleme devam edin.
Filtrelerin Depolama
1. Filtrelerin saklamak için, ilk defa 30-60 ml şırınga ile kalan suyu dışarı atmak.
2. Parafilm Sterivex filtrenin alt Seal. Bir pipet kullanarak, daha sonra ek reaktifler filtre alanı yaklaşık 200 ül tutarak, filtre 1.8ml lizis tamponu ekleyin.
3. Sonra, küçük bir parça ile Parafilm Sterivex filtre üst mühür ve tarih ve örnek tanımlama filtreleri etiket.
4. Etiketli öncesi 50 ml şahin tüpler filtreler Mağaza -80 ° C
Temizlemek
1. % 0.1 HCl içeren bir balona 25 ml pipet yerleştirin ve pompa açın.
2. HCl yıkama sonra tüp, otoklavlanmış su ile durulayın.
  
  Son olarak, ölçmek ve filtre geçen su hacmini hesaplamak için artık boş 1L şişeleri kitle kayıt.

Temsilcisi Sonuçlar: Her 1 L su numunesi 0.22 mm daha fazla biyokütle içeren bir Sterivix filtresi, elde edilebilir . Bu lizis tamponu sonraki DNA ekstraksiyonu ve analiz için saklanır. Nihai sonuç, bir Sterivix lizis tamponu saklanan 1 litrelik şişe başına filtre ve DNA ekstraksiyonu için hazır oluşur. Filtre 0.22 mm daha fazla biyokütle içerir. Filtreler, -80 ° C Edna çıkarma önce saklanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tezgahları ve pompalar, aksi takdirde ekipman paslanmasına neden olur tuzlu su herhangi bir kalıcı izlerini kaldırmak için kullanımdan sonra nemli bir havlu ile temizlemek için şarttır. Işlem basit olmasına rağmen, zaman gereksinimi süzülen örnek biyokütle ya da enkaz konsantrasyonuna bağlı olarak geniş olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Yenilik, British Columbia Bilgi Kalkınma Fonu ve Ulusal Bilimler ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Kanada Kanada Vakfı Biz, kıyı ve açık okyanus sularında düşük oksijen bölgelerde devam eden çalışmalar destek için teşekkür etmek istiyorum. DAW NSERC, Killam ve TULA vakıf Mikrobiyal Çeşitlilik ve Evrim finanse Merkezi burs tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic pump	Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL tubing	Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	For filtration apparatus
Hose clamps	Cole-Parmer	0683204	For filtration apparatus
1/4” x 3/16” pipe adaptors	Cole-Parmer	31702-20	For filtration apparatus
Polypropylene prefilter housing	ADVANTEC	501200	For filtration apparatus
Metal luer fitting (Hose end to Male luer lock)	Cole-Parmer	31507-27	For filtration apparatus
2“ Magnets			For filtration apparatus
3 port carboy caps			For filtration apparatus
GV 0.22 μm STERIVIX filters	EMD Millipore	SVGV01R5
47 mm diameter 2.7 μm GF/D filters	Whatman, GE Healthcare	1823047
Lysis buffer			0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)
0.1 % HCl			For post-filtration rinse
Autoclaved water			For post-filtration rinse