הביתור, הקלטה מ צומת C. elegans Neuromuscular

Summary

יישום electrophysiology כדי סינפסות נגיש מספק מדד לכימות הפעילות הסינפטית, שימושי בניתוח מוטנטים הסינפטי. מאמר זה מתאר שיטה לנתיחה נהג לחשוף את בצמתים neuromuscular (NMJ) של

Abstract

עצבית היא תהליך שבו הנוירונים להעביר מידע באמצעות אותות כימיים למטרות פוסט סינפטית שלהם, בסולם זמן מהיר. זה תהליך מורכב, דורש את פעילות מתואמת של חלבונים קדם ופוסט סינפטיים רבים כדי להבטיח קישוריות סינפטי המתאים, ההולכה של האותות החשמליים, מיקוד תחול של שלפוחיות הפרשה, חישה סידן, איחוי שלפוחית, לוקליזציה והתפקוד של הקולטנים postsynaptic ולבסוף, מיחזור מנגנונים. כמו מדעני המוח היא המטרה שלנו להבהיר אילו חלבונים לתפקד בכל אחד מהשלבים הללו ולהבין את מנגנוני הפעולה שלהם. הקלטות אלקטרו מן הסינפסות לספק לכימות לקרוא את האירועים החשמליים הבסיסיים המתרחשים במהלך שידור סינפטי. על ידי שילוב של טכניקה זו עם מערך רב עוצמה של כלים מולקולריים וגנטיים זמין לתפעל חלבונים סינפטיים ב C. elegans, אנחנו יכולים לנתח את השינויים תפקודית וכתוצאה מכך בשידור סינפטי.

ג elegans NMJs שנוצר בין הנוירונים המוטוריים קיר גוף שרירי תנועה מלאה, ולכן מוטציות עם פנוטיפים locomotory מתואמים (המכונה UNC ים) לעתים קרובות השידור הסינפטי להפריע בכל אלה סינפסות ^1. מאז מוטנטים UNC מתוחזקים על היצע עשיר של מזון ממקור חיידקי, הם נשארים קיימא כל עוד הם שומרים על כמה יכולת שאיבה בלוע לבלוע מזון. זה, יחד עם העובדה כי ג elegans קיימים הרמפרודיטים, מאפשר להם לעבור על הצאצאים מוטציה ללא צורך התנהגויות ההזדווגות לפרט. תכונות אלה, בשילוב עם היכולת שלנו לאחרונה להקליט התולעים NMJs ^2,3,7 להפוך את זה אורגניזם מודל מצוין שבו לכתובת בדיוק איך UNC עצבית מוטנטים השפעה.

שיטת הניתוח כרוך תולעים בוגרות לשתק באמצעות דבק cyanoacrylic כדי להפוך חתך לציפורן תולעת חשיפת NMJs. מאז ג מבוגרים elegans רק 1 מ"מ באורך לנתיחה מבוצע תוך שימוש במיקרוסקופ לנתח ודורש תיאום מצוין בין העין ליד. הקלטות NMJ מבוצעים על ידי כל תא מתח clamping הפרט קיר השרירים בגוף תאים ושחרור הנוירוטרנסמיטר ניתן עורר באמצעות מגוון של פרוטוקולי כולל גירוי גירוי חשמלי, אור הופעל ערוץ rhodopsin בתיווך שלילת קוטביות ⁴ ו hyperosmotic מלוחים, אשר כולם יהיו תיאר בקצרה.

Protocol

א הכנת הכלים המשמשים לניתוח.

1. חדר דיסקציה / הקלטה: אנחנו בדרך כלל לבנות חדר הקלטה שלנו מתוך גיליון 1 / 16 ^ה מגנטי אינץ', עם חור עגול קדח למרכז כי הוא גדול מספיק כדי להכיל בקוטר 22 מ"מ מכסה זכוכית עגולה. הממדים החיצוניים של החדר יהיה תלוי בשלב מיקרוסקופ נהגו לעשות את ההקלטות. בצד האחורי של הגיליון מגנטי, אנו לצרף 48 x 60 מ"מ לכסות להחליק, שבו אנו דבקים החדר ידי הצבת גלולה נמוך השעווה נמסה Paraplax רקמות הטבעה בכל פינה של העטיפה לחמוק דחוקה בין הזכוכית לתא . השעווה נמסה ואז על פלטה חשמלית, צלחת זכוכית פונה כלפי מעלה, עד שהוא יוצר שכבת הדבקה רציפה להחליק מכסה לתא. אין להשאיר בשלב זה ללא השגחה כמו השעווה נמס במהירות. החדר צריך להיות מקורר להסיר בהקדם השעווה נמס. שעווה עודף זה חלחל לאורך הקצה הפנימי של חלל מעגלי 22mm ניתן להסיר בעזרת קצה סכין גילוח.
2. Sylgard מצופה תלושי לכסות: לנתיחה מבוצע על 22 מ"מ, מצופה Sylgard להחליק לכסות כי הוא ממוקם בתוך חלל עגול של חדר ההקלטה. מעיל Sylgard עוזר דבק cyanoacrylic לדבוק לכסות את תלוש כאשר הדבקת את התולעים למטה פועלת גם כרית שעליה לשבור בחזרה את הדבק פיפטה קצה כאשר הוא הופך להיות פקוק. Sylgard מורכב טריים על פי הוראות מייצרת (10 חלקי בסיס סיליקון 1 חלק ריפוי סוכן לפי משקל). טיפה קטנה של Sylgard ממוקם אז להחליק על כל כיסוי מרוח על פני באמצעות קצה סכין גילוח לעשות משטח אפילו. תלושי העטיפה מצופה ממוקמות מכולות גדול מכוסה שטוח ושמאלה בתנור תואר 65 ° לילה לרפא.
3. Pipettes: בדרך כלל, אנו משתמשים באותה 1 מ"מ קוטר חיצוני נימה זכוכית בורוסיליקט כדי ליצור את pipettes עבור תולעים הדבקה למטה, ביצוע חתכים לציפורן הקלטה מהשרירים, חולץ באמצעות אלקטרודה. רצוי למשוך צנצנת pipettes לפני שתנסה לנתיחה כשלב זה יכול לדרוש חילופי מהירה כמה pipettes.
4. המוליך דבק: דבק נטען ויישומי מקצה טפטפת דבק, בלחץ הפה. פיפטה הדבקה מוכנס לתוך קצה אחד של פיסת 2 מטר של צינורות מפוליאתילן בקוטר פנימי שמתאים קוטר חיצוני של הכוס פיפטה (בדרך כלל 1 מ"מ). הקצה השני של הצינור בעל קצה פיפטה Eppendorf שפועל חתיכת הפה.
5. הפקת פיפטה: הקרביים תולעת יש להסיר מחלל את התולעת פעם את החתך לציפורן נעשה. זו מושגת עם חתיכת צינור המחובר בקצה Eppendorf פיפטה דומה המוליך את הדבק אבל במקרה הזה החילוץ זכוכית קצה פיפטה נשבר בחזרה מספיק כדי לאפשר ביצים הקרביים להיות בקלות שאב מתוך חלל תולעת.

ב דיסקציה

1. בחדר הקלטה קו מעגלי בעט שעווה נמשך קרוב למתחם של החדר שבו תלוש Sylgard מצופה לכסות נלחץ במקומו (Sylgard-מעיל פונה מעלה). קו זה שעווה שמגביל את הפתק לכסות ומונע את פתרון הקלטה מ מחלחל מתחת פירוק להחליק לכסות במהלך דיסקציה הקלטה. החדר מתמלא אז עם פתרון הקלטה תאיים ותולעים מספר ממוקמים במרכז באמצעות לאסוף תולעת. תולעים ישחו פתרון, אך עם תרגול, תולעים אלו יכולים להיות מודבק למטה ללא כל הליכים נוספים כגון קירור למנוע תנועה. בשלב ההכשרה, זה יכול לעזור לתרגל תולעים הדבקה מוטציה שבה שחייה נפגעת (כגון UNC-31 מוטנטים).
2. מיכל דבק נושן מתוך כובע PCR שנערכה שעווה או פלסטלינה, משמש להחזיק מלאי העבודה של הדבק cyanoacrylic. Pipettes דבק עם ממדים קצה דומה pipettes הקלטה (בדרך כלל ~ 4 megohms התנגדות) משמשים ליישם דבק. בעזרת המוליך דבק, כמות קטנה של דבק נשאב לתוך פיפטה דבק, באמצעות היקף לנתיחה כדי להמחיש את קצה פיפטה כמו דבק נמצץ.
3. הדבק cyanoacrylic (HistoacrylBlue, Aesulap) polymerizes במגע עם פתרון הקלטה תאית, ולכן חשוב לשמור על לחץ חיובי על פיפטה דבק כפי שהוא מזין את הפתרון קאמרית למנוע דבק התקשות חיבור פיפטה. ברגע פיפטה הוא דבק בפתרון קאמרית, זרם קטן אך קבוע של דבק צריך להיות מיושם על פני השטח Sylgard תחת שליטה הפה הלחץ כדי למנוע חיבור. אם פיפטה הופך לחשמל זה לפעמים יכול להיות חסומות על ידי הקשה על קצה בעדינות על זכוכית sylgard מצופה. מומלץ לך להתאמן הדבקה לפני שתנסה תולעים דבק. אם אתה יכול לכתוב באופן קבוע את שמך דבק על Sylgard, עם אותיות עשוי קווי רזה יותר רוחב התולעים אתה מוכן proceed כדי הדבקה לציפורן תולעת.
4. כדי להדביק תולעת, להפעיל לחץ חיובי לצרף כמות קטנה של דבק על הראש או הזנב של התולעת במהירות לצייר את התולעת מטה אל פני השטח Sylgard. נסו לצרף את התולעת סמוך למרכז החדר כמו תולעים מודבק קרוב מדי לקצה יהיה קשה להגיע עם pipettes ההקלטה. ואז להחיל זרם בלתי פוסק של דבק לאורך הקצה הגבי של לציפורן של התולעת מתוך הקובץ המצורף החל, מה שאילץ את התולעת למצב-C עם הפות פונה פנימה (עבור הקלטות שרירים הגחון). פערים כל דבק בקו הזה צריך למלא כך את התולעת מחוברת חזק, כדי למנוע את התולעת מתוך ניתוק במהלך שלב את החתך לציפורן.
5. כדי לבצע את החתך לציפורן, לעבור פיפטה כף יד לנתיחה. פיפטה זה צריך להיות חד יותר דבק / הקלטה pipettes ויש לי מוט קצר, חסון. השימוש הגבוה ביותר בהגדלה על היקף הניתוחים, ליישר את פיפטה מקביל לציר האורך של התולעת והכנס את קצה על נקודת האמצע לאורך התולעת (קרוב ל הפות) עושה את החתך על הממשק לציפורן / הדבק. חתך זה משחרר את הלחץ ההידרוסטטי תולעים לאלץ ביצים המעיים החוצה דרך נקודת החתך. המשך קיצוץ ציפורניים לקראת ראש התולעת בתנועת חיתוך דומה פתיחת מכתב, עד שתגיע הלוע. החלף לידי פיפטה החילוץ ואקום את האיברים הפנימיים של התולעת. לאחר ניקוי החתך, את הקוטיקולה פתח ישמרו על צורה גלילית זה. השתמש פיפטה הדבקה טריים במקום לרתך לחתוך את הקצה של לציפורן מטה אל פני השטח Sylgard. חשוב להשתמש כתמי דבק מינימלי בשלב זה כדי למנוע נזק או להסתיר את NMJs.
   הגחון כבל גוף עצב קיר השרירים חשופים עכשיו.
6. כדי להסיר את הקרום המכסה את המרתף NMJs, למצוץ את פתרון ההקלטה תאיים מהאולם וליישם collagenase (0.4mg/ml פתרון הקלטה תאית) למשך כ 10-20 שניות, להסיר ולשטוף מספר פעמים עם פתרון טרי הקלטה תאיים. המשך לשלב את ההקלטה.

ג Patch-clamp הקלטה

1. מקם את תא הקלטת על הבמה את הימין מיקרוסקופ באמצעות המטרה 10X למרכז תולעת. עבור מטרה מים emersion 40X עם DIC ולבדוק כי הקיר גוף שרירי וחוט עצב שלמות. מקם את התולעת כך ציר האורך של התולעת הוא במקביל הקצה הקדמי של היקף, המאפשר אלקטרודות להיות הציג משני הצדדים על ימין ועל שמאל.
2. תיקון השריר באמצעות תקן תיקון-clamping טכניקות. אלקטרודות הקלטה של ​​ההתנגדות על megohms 4 לעבוד היטב. לאחר האלקטרודה נוגעת קרום השריר, עלייה בלחץ שלילי עד חותם gigohm מתקבל. עבור למצב מתח-clamp כל תא הקלטה, להחיל יניקה יותר zap הממברנה עד לאטום gigohm מקרע. בשנת הקלטה טובה, גוף שרירי קיר wild-type תולעים בוגרות יש בדרך כלל קיבול קרום התא של pF 70 ~ והוא יכול להיות מוקלט ביציבות על פוטנציאל החזקת mV -60 עם זרמים מחזיק מינימלי (~ 50 לפחות 10 דקות הרשות הפלסטינית).
3. פתרון הקלטה תאי מורכב (מ"מ): 150 NaCl, KCl 5, CaCl ₂ 5, MgCl ₂ 4, 10 גלוקוז, סוכרוז 5, HEPES 15 (pH 7.3, 330mOsm ~). פיפטה תיקון כולל (מ"מ): 120 KCl, KOH 20, MgCl _2, 4 (N-טריס [Hydroxymethyl] mthyl-2-aminoethane-חומצה sulfonic) TES 5, Dihydrate CaCl ₂ 0.25, Na ₂ ATP 4, סוכרוז 36 , EGTA 5 (pH 7.2, ~ 312 mOsm). הערה: פתרונות אלה באופן מלאכותי לתאי השריר עומס עם כלוריד, כך GABA קולטן בתיווך זרמים הן כלפי פנים עקב בזרימת כלוריד על פוטנציאל החזקת mV -60. וריאציות על הפתרונות הללו היו בשימוש (ראה פרסומים לפרטים נוספים).
4. עורר לשחרר. בדרך כלל אנחנו במקום אלקטרודה נוספת שהכילה פתרון תאיים על הגחון הקדמי חוט העצב לשריר תוקנו. תצורה זו דורש תיקון רופף גירויים depolarizing גדול (בסדר גודל של 10s של וולט) למשך זמן קצר (1-2ms) כדי להשיג את התגובות שעוררו מקסימלי (בדרך כלל 2.0-2.5 NA) בשנת wild-type תולעים. המגבלות של גישה זו הם: 1) רק עורר כמה תגובות ניתן לשלוח לפני העצב ניזוק באופן בלתי הפיך ו 2) מסיבות לא ידועות, רק עורר תגובות cholinergic ניתן לקבל באמצעות גירוי תצורה זו.
5. אור הופעל ערוץ rhodopsin גירוי. לאחרונה, מעבדה גוטשלק יצרה תולעים מהונדס המבטא אצות הנגזרות rhodopsins ערוץ depolarize הממברנה על גירוי אור תת קבוצות של נוירונים, בהתאם האמרגן להשתמש בכונן ביטוי ^4. במקרה של ג elegans NMJ, קווי משולב להביע ערוץ rhodopsin באחת הנוירונים מנוע cholinergic או נוירונים מנוע GABAergic כעת availablה מאז ערוץ rhodopsin רק מגיב אור כאשר כל טרנס הרשתית קשורה מחצית opsin, תולעים המשמש עבור יישום זה חייב להיות גדל על חיידקים מהול הרשתית. פולס האור הירוק לאחר מכן ניתן להשתמש שוב ושוב להפעיל את rhodopsin ערוץ גרימת שחרור עורר או של אח או GABA, בהתאם תולעים מהונדס משמשים. תולעים אלה מהונדס ניתן חצו לתוך זנים מוטנטים. היתרון של שיטה זו על גירוי חשמלי הקודמת כוללים: 1) אור ההפעלה אינו גורם נזק עצבי, המאפשר לחזור גירויים רבים להתבצע ו 2) עורר שחרור או נוירונים מנוע GABAergic או cholinergic ניתן ללמוד באופן עצמאי.
6. Hyperosmotic-Induced שחרור. כדי למדוד את גודל הבריכה שלפוחית ​​בקלות-releasable (המשקף את הבריכה סיכם של שלפוחית ​​דרוך מכל של NMJ על השריר מוקלט), הלחץ פיפטה המכיל פתרון תאיים hyperosmotic (במונחי mOsm 850 ~ ידי הוספת סוכרוז נוספים) משמש. לחץ הדופק יישומים של 1-3 שניות לייצר מטח של הפוסט סינפטי אירועים אסינכרוני באמצעות פתרונות סטנדרטיים שתוארו לעיל.

איור 1: סקירה סכמטי של C. elegans לנתיחה ותצורת ההקלטה neuromuscular

Coverslip מצופה sylgard שנעשו על ידי ירידה מריחות של Sylgard פני הזכוכית וריפוי לילה ממוקם חלל עגול של חדר הקלטה טרומיים מכוסה פתרון הקלטה. תולעת ממוקם במרכז מודבק לפני השטח Sylgard החל הראש או הזנב, יישום דבק בצד הגבי של התולעת, בעזרת פיפטה דבק. לאחר הדבקה תושלם, חתך סמוך הפות, בממשק שבין לציפורן ודבק הוא עשה עם מחט זכוכית ארוכה לכיוון הראש (ראה קו אדום מחורר). בעקבות החילוץ של הקרביים וביצים מחלל את הגוף, לחתוך את הקצה של החתך הוא ספוט מרותך עם דבק Sylgard כדי לחשוף את עצב הגחוני (ירוק) ועל הקיר גוף שרירי (אדום). השריר הגחון-המדיאלי הקדמי כדי הפות הוא תיקון, הידק את האלקטרודה מגרה ממוקם במעלה הזרם על חוט העצב.

נציג תוצאות

שלמות התא, מתח, הידק קיר הגוף הקלטות שרירים מוצגים עבור כל אחד משלושת הפרוטוקולים גירוי שתוארו לעיל (מעוררים חשמלית, אור עורר ותגובות hyperosmotic). בכל המקרים הגחון-המדיאלי הקיר שריר בגוף הוא הידק ב -60 mV. א wild-type לתאי השריר בדרך כלל להציג שיעור גבוה של זרמי פנימה אנדוגניים סינפטי מיניאטורי בפתרונות הקלטה הרגילה שלנו. ב שלילת קוטביות 2ms של חוט העצב הקדמי הגחון גורמת לשחרור סינכרוני של סינפסות מספר וכתוצאה מכך תגובה עורר גדול של NA סביב 2-2.5 ב wild-type תולעים. עקבות נציג ימינה של wild-type עקבות A ו-B להראות לשחרור סינפטי של מוטנט חסר קואורדינציה קשות (UNC-18). לוח ג מראה תגובה אור עורר מצומת neuromuscular של התולעת wild-type להביע ערוץ rhodopsin בנוירונים cholinergic. הדופק 2ms אור בדרך כלל מייצרת תגובה של NA 1.5-1.8. ד בלחץ פליטה של ​​תמיסת מלח 850 mOsm hyperosmotic על השריר עבור 1s, מייצרת מטח אסינכרוני של זרמים סינפטיים מיניאטוריים המייצגים את הבריכה בקלות-releasable של שלפוחית.

Discussion

אורגניזם גנטי המודל C, elegans הוא אידיאלי ללימוד בשידור סינפטי, דרך ניתוח פונקציונלי של מוטציות הגנים המקודדים חלבונים סינפטיים. כאן יש לנו תיאר טכניקה לנתיחה המעבדת את C. elegans NMJs נגיש לניתוח אלקטרו. הסרטון מלווה מתאר את השלבים הקריטיים של C. elegans לנתיחה ואת תצורת הקלטה טיפוסי למדידת הפעילות הסינפטית. שלושה שלבים המהווים את האתגרים הגדולים ביותר למידה בטכניקה זו הם: 1) הדבקה בתולעת צעד, 2) ביצוע החתך בהצלחה, 3) תיקון על שרירי הגוף הקיר. פעם אלה היו שולטים, הכנה זו ניתנת הקלטה של ​​שרירים שלאחר הסינפטי באחת מהדק מתח או מהדק מצבי הנוכחי. התגובות לגירויים עורר ניתן למדוד בקלות באמצעות הכנה גזור במגוון רקע מוטנטים. בהתחשב בגודל של תולעת דקה כבר wild-type הבוגרת (1 מ"מ אורך), מוטציות הסינפטי שאינם מגיעים לבגרות או להישאר רזה לא יכול להיות נוח לגישה זו לנתיחה. הנוירונים המנוע של חוט העצב הגחון גם קטן מאוד (2-5 תאים של סומה מיקרומטר) ואת אתגרים נוספים electrophysiologists, אם כי יש מספר מעבדות נרשם בהצלחה C. נוירונים elegans בווריאציות של הכנת גזור המתואר כאן ^{5 6.}