Dissezione e registrazione dal bivio C. Elegans neuromuscolare

Summary

Applicazione di elettrofisiologia di sinapsi accessibile fornisce una misura quantificabile di attività sinaptica, utile per analizzare mutanti sinaptica. Questo articolo descrive un metodo di dissezione utilizzati per esporre le giunzioni neuromuscolari (NMJ) di

Abstract

Neurotrasmissione è il processo attraverso il quale i neuroni trasferire informazioni attraverso segnali chimici per la loro post-sinaptico obiettivi, su una scala temporale rapido. Questo processo complesso richiede l'attività coordinata di molte proteine ​​pre-e post-sinaptica per assicurare corretto funzionamento della connessione sinaptica, la conduzione dei segnali elettrici, targeting e di adescamento di vescicole secretorie, il rilevamento di calcio, la fusione delle vescicole, la localizzazione e la funzione dei recettori postsinaptici e, infine, il riciclaggio meccanismi. Come neuroscienziati è il nostro obiettivo di chiarire quali proteine ​​funzione in ciascuno di questi passi e capire i loro meccanismi di azione. Le registrazioni elettrofisiologiche da sinapsi fornire una quantificabile leggere degli eventi di riferimento elettriche che si verificano durante la trasmissione sinaptica. Combinando questa tecnica con il potente gamma di strumenti molecolari e genetici disponibili per manipolare proteine ​​sinaptiche in C. elegans, possiamo analizzare le conseguenti modifiche funzionali nella trasmissione sinaptica.

Il C. elegans NMJs formano tra i neuroni motori e la parete muscolare del corpo locomozione di controllo, quindi, mutanti con fenotipi motoria scoordinata (noto come unc s) spesso perturbano la trasmissione sinaptica a queste sinapsi ^1. Dal momento che i mutanti unc sono mantenuti su una ricca offerta di una fonte di cibo batterica, rimangono valide fino a quando mantengono una certa capacità di pompaggio della faringe di ingerire cibo. Questo, unitamente al fatto che C. elegans esistono come ermafroditi, permette loro di passare per la prole mutante senza la necessità di comportamenti di accoppiamento elaborati. Queste caratteristiche, insieme alla nostra capacità di recente per registrare dal worm NMJs ^2,3,7 fanno di questo organismo un ottimo modello in cui per affrontare con precisione come unc neurotrasmissione impatto mutanti.

Il metodo di dissezione coinvolge vermi adulti immobilizzare con una colla cianoacrilica per fare un'incisione nella cuticola verme esponendo il NMJs. Dal C. adulti elegans sono solo 1 mm di lunghezza viene eseguita la dissezione con l'utilizzo di un microscopio da dissezione e richiede un'ottima coordinazione occhio-mano. NMJ registrazioni sono fatte da cellula intera tensione di serraggio singolo corpo le cellule muscolari della parete e il rilascio dei neurotrasmettitori possono essere evocati utilizzando una varietà di protocolli di stimolazione tra cui la stimolazione elettrica, la luce-attivati ​​canali rodopsina-mediata depolarizzazione ⁴ e salina iperosmotico, ognuno dei quali sarà brevemente descritto.

Protocol

A. Preparazione di strumenti utilizzati per la dissezione.

1. La dissezione / camera di registrazione: Noi di solito costruire la nostra camera di registrazione da un 1 / 16 ^° foglio pollici magnetico, con un foro circolare forato al centro che è grande abbastanza per ospitare un diametro di 22 mm circolare vetro di copertura. Le dimensioni esterne della camera dipende dal palco microscopio utilizzato per fare le registrazioni. Sul lato opposto del foglio magnetico, si allega un x 48 60 vetrino mm, che aderiamo alla camera mettendo una pallina di cera bassa tessuto fondere Paraplax embedding in ogni angolo della copertina scivolare inserita tra il vetro e la camera . La cera viene sciolta in un piatto caldo, piastra di vetro rivolto verso l'alto, fino a formare una strato di incollaggio continuo scivolare il coperchio alla camera. Non lasciare incustoditi questo passo come la cera si scioglie in fretta. La camera deve essere rimosso e raffreddato, non appena la cera si è sciolta. Cera in eccesso che si è infiltrata lungo il bordo interno della cavità circolare 22 millimetri può essere rimosso utilizzando una lama di rasoio.
2. Sylgard rivestita scivola copertina: La dissezione viene eseguita su un 22 mm, rivestite Sylgard vetrino che viene inserito all'interno della cavità circolare della camera di registrazione. Il mantello Sylgard aiuta la colla cianoacrilica aderire alla copertura scivolare durante l'incollaggio i vermi verso il basso e agisce anche come un cuscino su cui rompere di nuovo la colla pipetta punta quando diventa collegato. Sylgard è costituito fresco secondo le istruzioni di produttori (10 silicone parti di base per 1 parte di catalizzatore in peso). Una piccola goccia di Sylgard è quindi posto su ogni vetrino e spalmato in tutto con un filo della lama di rasoio per fare una superficie piana. Le polizze di copertura rivestita sono poste in grandi contenitori piatto coperto e lasciato in forno a 65 ° gradi durante la notte per curare.
3. Pipette: in genere, usiamo lo stesso 1 millimetro di diametro esterno filamenti di vetro borosilicato per generare le pipette per i vermi incollatura verso il basso, rendendo incisioni cuticola e la registrazione da muscoli, utilizzando un elettrodo estrattore. Si consiglia di tirare un vaso di pipette prima di tentare una dissezione di questa fase può richiedere parecchi scambi rapidi di pipette.
4. Applicatore Colla: Colla viene caricato e applicato dalla punta di una pipetta di colla, per bocca di pressione. La pipetta incollaggio viene inserito in una estremità di un pezzo 2 metri di tubo in polietilene con diametro interno che corrisponde al diametro esterno della pipetta di vetro (di solito 1 mm). L'altra estremità del tubo detiene una punta della pipetta eppendorf che agisce come un pezzo bocca.
5. Estrazione pipetta: I visceri verme deve essere rimosso dalla cavità verme una volta che l'incisione cuticola è stato fatto. Questo risultato è ottenuto con un pezzo di tubo collegato ad un punta della pipetta eppendorf simile al applicatore colla ma in questo caso l'estrazione punta della pipetta di vetro è rotto di nuovo a sufficienza per permettere le uova e visceri per essere facilmente aspirato dalla cavità worm.

B. La dissezione

1. Nella camera di registrazione di una circolare linea tracciata a penna cera è avvicinato al perimetro della camera a cui si preme un Sylgard rivestimento antiscivolo coperchio saldamente in posizione (Sylgard-coat verso l'alto). Questa linea di cera immobilizza la polizza di copertura e impedisce la soluzione di registrazione di colare sotto e staccare il vetrino durante la dissezione e la registrazione. La camera viene poi riempito con una soluzione di registrazione extracellulare e vermi diversi sono posti al centro con un pick verme. Worms nuoterà in soluzione, tuttavia con la pratica, questi worm possono essere incollate, senza ulteriori procedure come il raffreddamento per evitare movimenti. Durante la fase di formazione, può aiutare a praticare worm incollaggio mutante in cui è compromessa nuoto (come mutanti unc-31).
2. Un contenitore di colla ricavata da un tappo di PCR tenuto in cera o creta, è usato per tenere una scorta di lavoro della colla cianoacrilica. Pipette colla punta di dimensioni simili alle pipette di registrazione (di solito ~ 4 megaohm resistenza) sono utilizzati per applicare la colla. Utilizzando l'applicatore di colla, una piccola quantità di colla viene aspirata nella pipetta colla, utilizzando la portata dissezione di visualizzare la punta della pipetta da collante viene aspirata.
3. La colla cianoacrilica (HistoacrylBlue, Aesulap) polimerizza a contatto con soluzione di registrazione extracellulare, quindi è importante mantenere la pressione positiva sulla pipetta colla, che entra nella camera di soluzione per evitare che la colla di indurimento e collegare la pipetta. Non appena la colla è pipetta nella soluzione di camera, un piccolo ruscello ma costante di colla deve essere applicata sulla superficie Sylgard in bocca-il controllo della pressione per evitare intasamenti. Se la pipetta viene collegato a volte può essere sbloccato picchiettando delicatamente la punta sulla sylgard rivestita di vetro. Si consiglia di fare pratica prima di provare a incollare worm colla. Se si riesce a scrivere regolarmente il proprio nome in colla sulla Sylgard, con lettere fatte di linee sottili rispetto alla larghezza worm si è pronti per proceed per incollaggio la cuticola worm.
4. Per incollare un worm, utilizzare a pressione positiva di allegare una piccola quantità di colla sia il capo o la coda del worm e rapidamente disegnare il verme verso il basso sulla superficie Sylgard. Provate a collegare il verme vicino al centro della camera come vermi incollati troppo vicino al bordo sarà difficile da raggiungere con pipette di registrazione. Quindi applicare un flusso costante di colla lungo il bordo dorsale della cuticola del worm al distacco di partenza, costringendo il worm in un C-posizione con la vulva rivolti verso l'interno (per le registrazioni dei muscoli ventrali). Eventuali lacune in questa linea di colla deve essere compilato in modo che il worm è fortemente collegata, per evitare che il worm si stacchi durante la fase di incisione cuticola.
5. Per rendere l'incisione cuticola, passare a una mano pipetta dissezione. Questo pipetta deve essere più tagliente di colla / pipette di registrazione e hanno un breve, albero robusto. Usando il più alto ingrandimento sulla portata dissezione, allineare la pipetta parallelo all'asse longitudinale del worm e inserire la punta di metà lungo il worm (vicino alla vulva), rendendo l'incisione presso la cuticola / colla interfaccia. Questa incisione rilascia la pressione idrostatica vermi costringendo uova e nell'intestino attraverso il punto di incisione. Continuare a tagliare le cuticole verso la testa del worm con un movimento simile ad affettare l'apertura di una lettera, fino a raggiungere la faringe. Passare alla pipetta di estrazione a vuoto fuori gli organi interni del worm. Dopo aver eliminato l'incisione, la cuticola aperto manterrà la sua forma cilindrica. Utilizzare una pipetta fresca incollaggio a punto di saldatura del bordo tagliato della cuticola verso il basso sulla superficie Sylgard. E 'importante usare i punti colla minima in questa fase per evitare di danneggiare o oscurando la NMJs.
   I muscoli della parete ventrale del nervo cavo e il corpo sono ora esposti.
6. Per rimuovere la membrana basale che copre il NMJs, succhiano la soluzione extracellulare registrazione dalla camera e applicare collagenasi (0.4mg/ml nella soluzione di registrazione extracellulare) per circa 10-20 secondi, togliere e lavare più volte con nuove soluzione di registrazione extracellulare. Procedere alla fase di registrazione.

C. patch-clamp registrazione

1. Posizionare la camera di registrazione su un up-destra stadio microscopio usando un obiettivo 10X per centrare il worm. Passare ad una 40X acqua emersione obiettivo con DIC e verificare che i muscoli del corpo a parete e cavo di nervi sono intatti. Posizionare il verme in modo che l'asse longitudinale del worm è parallelo con il bordo anteriore del campo di applicazione, permettendo elettrodi è stato introdotto da entrambi i lati sinistro e destro.
2. Patch del muscolo utilizzando le normali tecniche di patch-bloccaggio. Elettrodi di registrazione di circa 4 megaohm resistenza funzionano bene. Una volta che l'elettrodo tocca la membrana muscolare, aumentare la pressione negativa fino a quando un sigillo gigohm si ottiene. Per l'intero-cellula voltage-clamp modalità di registrazione, applicare più di aspirazione e di zapping la membrana fino a quando il sigillo gigohm è rotta. In una buona registrazione, i muscoli del corpo muro di wild-type vermi adulti in genere hanno una membrana cellulare capacità di circa 70 pF e può essere stabilmente registrato per almeno 10 minuti a una potenziale detenzione di -60 mV con un minimo correnti holding (~ 50 pA).
3. La soluzione di registrazione extracellulare è costituito da (in mM): NaCl 150, KCl 5, CaCl ₂ 5, MgCl ₂ 4, glucosio 10, saccarosio 5, HEPES 15 (pH 7,3, 330mOsm ~). La pipetta cerotto contiene (in mm): KCl 120, KOH 20, MgCl ₂ 4, (N-tris [idrossimetil] mthyl-2-amminoetanetiolo-solfonico) TES 5, diidrato CaCl ₂ 0,25, Na ₂ ATP 4, saccarosio 36 , EGTA 5 (pH 7,2, ~ 312 mOsm). Nota: Queste soluzioni artificialmente carico cellule muscolari con il cloruro, in modo che il recettore GABA-mediata correnti verso l'interno a causa di efflusso cloruro ad un potenziale detenzione di -60 mV. Variazioni su queste soluzioni sono state utilizzate (vedi le pubblicazioni per i dettagli).
4. Evocati rilascio. Di solito abbiamo posto un secondo elettrodo contenente soluzione extracellulare sulla anteriore ventrale cordone nervoso al muscolo patch. Questa configurazione di patch perdere richiede grandi stimoli depolarizzanti (dell'ordine di 10s di volt) di breve durata (1-2ms) per ottenere la massima risposte evocate (tipicamente 2,0-2,5 nA) nel wild-type vermi. Le limitazioni di questo approccio sono: 1) Solo alcune risposte evocate possono essere consegnati prima che il cordone nervoso è danneggiato in modo irreversibile e 2) Per ragioni sconosciute, solo le risposte possono essere evocate colinergici suscitato utilizzando questa configurazione stimolazione.
5. Luce attivati ​​canali rodopsina stimolazione. Recentemente, il laboratorio di Gottschalk ha generato vermi transgenici che esprimono alghe derivati ​​rhodopsins canale che depolarizza la membrana sulla luce-stimolazione dei neuroni in sottoinsiemi, a seconda del promotore usato per guidare l'espressione ^4. Nel caso della C. elegans NMJ, linee integrate esprimendo canale rodopsina in entrambi i motoneuroni o neuroni colinergici motore GABAergici sono ora dispone. Dal canale rodopsina risponde solo alla luce quando tutto-trans retinico è associato con la frazione opsina, worm utilizzato per questa applicazione deve essere coltivate su batteri cucita con retina. Un impulso di luce verde può quindi essere utilizzata per attivare ripetutamente la rodopsina canale causando rilascio evocato di uno ACh o GABA, a seconda di quale vermi transgenici vengono utilizzati. Questi vermi transgenici può essere attraversato in ceppi mutanti. Il vantaggio di questa tecnica rispetto alla stimolazione elettrica precedenti includono: 1) Light-attivazione non causa danno neuronale, permettendo ripetere molti stimoli da svolgere e 2) Evocati rilascio da entrambi i motoneuroni GABAergici o colinergica può essere studiato in modo indipendente.
6. Iperosmotico indotta rilascio. Per misurare la dimensione del pool di vescicole facilmente sganciabile (che riflette la piscina riassunto delle vescicole innescato da tutte le NMJ è sul muscolo registrato), una pressione pipetta contenente iperosmotico soluzione extracellulare (regolato ~ 850 mOsm con l'aggiunta di saccarosio supplementari) viene utilizzato. Pressione impulsi applicazioni di 1-3 secondi produrre un fuoco di fila di asincrono post-sinaptica eventi utilizzando le soluzioni standard descritto in precedenza.

Figura 1: Schema della C. elegans dissezione e la configurazione di registrazione neuromuscolari

Un coprioggetto sylgard rivestito fatta da spalmare una goccia di Sylgard attraverso il vetro e curando tutta la notte si trova nella cavità circolare della camera di registrazione prefabbricate e coperto con soluzione di registrazione. Un worm posto al centro è incollato alla superficie Sylgard a partire dal capo né coda, applicare la colla sul lato dorsale del worm, con una pipetta colla,. Una volta che l'incollaggio è completo, un'incisione adiacente alla vulva, a livello di interfaccia tra la cuticola e la colla è fatta con un ago di vetro ed estesa verso la testa (vedi linea rossa perforato). Dopo l'estrazione dei visceri e uova dalle cavità del corpo, il bordo tagliato dell'incisione è saldato con la colla al Sylgard esponendo il nervo ventrale (verde) e muscoli della parete del corpo (rosso). Il ventrale-mediale del muscolo anteriore della vulva è patch-bloccato e l'elettrodo stimolante è posto a monte del cordone nervoso.

Rappresentante risultati

Whole-cell, tensione bloccato corpo registrazioni muscolare della parete sono indicati per ciascuna delle tre protocolli di stimolazione sopra descritti (elettricamente evocato, luce evocata e risposte iperosmotico). In tutti i casi il ventrale-mediale del muscolo parete del corpo è bloccato a -60 mV. A. wild-type cellule muscolari tipicamente presentano un alto tasso di endogene verso l'interno delle correnti in miniatura sinaptiche nelle nostre soluzioni di registrazione standard. B. Un 2ms depolarizzazione del cordone nervoso ventrale anteriore provoca il rilascio sincrono da sinapsi diverse con conseguente risposta evocata grande di circa 2-2,5 nA wild-type vermi. Tracce di rappresentanza a destra del wild-type tracce in A e B mostrano rilascio sinaptico in un grave scoordinata mutante (unc-18). Panel C presenta una risposta di luce evocata dalla giunzione neuromuscolare di una wild-type verme che esprimono canale rodopsina nei neuroni colinergici. Un 2ms impulso luminoso produce tipicamente una risposta di 1,5-1,8 nA. D. pressione espulsione di 850 mOsm salina iperosmotico sul muscolo per 1s, produce uno sbarramento asincrona di correnti sinaptiche in miniatura che rappresenta la piscina facilmente sganciabile di vescicole.

Discussion

Il modello genetico dell'organismo C, elegans è ideale per lo studio della trasmissione sinaptica, attraverso l'analisi funzionale delle mutazioni in geni che codificano proteine ​​sinaptiche. Qui abbiamo descritto una tecnica di dissezione che rende il C. elegans NMJs accessibili per l'analisi elettrofisiologiche. Il video che accompagna la mostra passaggi critici nella C. elegans dissezione e la configurazione tipica di registrazione utilizzato per misurare l'attività sinaptica. I tre passi che pongono grandi sfide per l'apprendimento di questa tecnica sono: 1) la fase di incollaggio verme, 2) eseguire una incisione di successo, e 3) l'applicazione di patch su muscoli della parete del corpo. Una volta che questi sono stati masterizzati, questa preparazione è riconducibile alla registrazione del post-sinaptica muscolare sia in tensione o corrente-clamp-clamp modalità. Risposte a stimoli evocati possono essere facilmente misurato con questa preparazione dissezionato in una varietà di sfondi mutante. Date le dimensioni già minuto di wild-type verme adulto (1 mm di lunghezza), mutanti sinaptica che non raggiungono l'età adulta o rimanere pelle e ossa non possono essere riconducibili a questo approccio dissezione. I motoneuroni del cordone nervoso ventrale sono anche molto piccoli (cellule soma di 2-5 micron) e pongono nuove sfide per elettrofisiologi, anche se molti laboratori hanno successo registrato da C. neuroni elegans in variazioni della preparazione sezionato qui descritti ^{5 6.}