Dissecação e gravação a partir da junção neuromuscular C. Elegans

Summary

Aplicação de eletrofisiologia às sinapses acessível fornece uma medida quantificável de atividade sináptica, útil na análise de mutantes sináptica. Este artigo descreve um método de dissecação usada para expor as junções neuromusculares (MNJ) de

Abstract

Neurotransmissão é o processo pelo qual os neurônios de transferência de informação através de sinais químicos para sua pós-sinápticos metas, numa escala de tempo rápido. Esse processo complexo exige a atividade coordenada de muitas proteínas pré e pós-sinápticos para garantir a conectividade sináptica apropriada, a condução de sinais elétricos, segmentação e priming de vesículas secretoras, detecção de cálcio, fusão de vesícula, localização e função de receptores pós-sinápticos e, finalmente, a reciclagem mecanismos. Neurocientistas como é o nosso objetivo de elucidar quais as proteínas em função de cada uma dessas etapas e compreender seus mecanismos de ação. Gravações eletrofisiológicas das sinapses fornecer uma quantificáveis ​​ler fora dos eventos subjacentes elétricos que ocorrem durante a transmissão sináptica. Ao combinar esta técnica com a poderosa gama de ferramentas moleculares e genéticos disponíveis para manipular proteínas sinápticas em C. elegans, podemos analisar as mudanças resultantes funcional na transmissão sináptica.

O C. elegans NMJs formadas entre neurônios motores e parede do corpo locomoção controlar os músculos, por isso, os mutantes com fenótipos descoordenada locomotora (conhecido como unc s), muitas vezes a transmissão sináptica perturbar a estes ^um sinapses. Desde unc mutantes são mantidos em uma fonte rica de uma fonte de alimento de bactérias, eles permanecem viáveis, desde que manter alguma capacidade de bombeamento da faringe para ingerir alimentos. Isto, juntamente com o fato de que C. elegans existir como hermafroditas, lhes permite passar progênie mutante sem a necessidade de comportamentos de acasalamento elaborado. Estes atributos, juntamente com nossa capacidade de gravar recentes do worms NMJs ^2,3,7 tornar este organismo modelo excelente para abordar precisamente como unc neurotransmissão impacto mutantes.

O método envolve a dissecção vermes adultos imobilizando usando uma cola cyanoacrylic, a fim de fazer uma incisão na cutícula verme expondo a NMJs. Desde C. adultos elegans são apenas 1 mm de comprimento a dissecção é realizada com o uso de um microscópio de dissecação e requer coordenação olho-mão excelente. MNJ gravações são feitas por toda célula de tensão de aperto individuais corpo células da parede muscular e liberação do neurotransmissor pode ser evocado através de uma variedade de protocolos de estimulação, incluindo a estimulação elétrica, activado pela luz despolarização canais rodopsina mediada ⁴ e hiperosmótico salino, os quais serão brevemente descritos.

Protocol

A. Preparação das ferramentas utilizadas para a dissecção.

1. A câmara de dissecção / gravação: Nós normalmente construímos nossa câmara de gravação de um 1 / 16 ^ª folha polegadas magnético, com um furo circular perfurado no centro que é grande o suficiente para acomodar a 22 mm de diâmetro tampa de vidro circular. As dimensões externas da câmara vai depender do estágio do microscópio usado para fazer as gravações. No verso da folha magnética, damos um 48 x 60 lamínula mm, qual aderimos à câmara pela colocação de um pellet de baixa cera derreter tecido Paraplax incorporação em cada canto da tampa de deslizamento imprensado entre o vidro ea câmara . A cera é então derreteu em uma chapa quente, chapa de vidro voltada para cima, até formar uma camada contínua de colagem da lamínula para a câmara. Não deixe esta etapa autônoma como a cera se derrete rapidamente. A câmara deve ser retirado e resfriado, logo que a cera derreter. Excesso de cera que se infiltrou ao longo da borda interna da cavidade 22 milímetros circular pode ser removido usando uma lâmina de barbear.
2. Desliza Sylgard revestido compreende: A dissecção é realizada em uma 22 mm, revestido Sylgard lamínula que é colocado dentro da cavidade circular da câmara de gravação. A pelagem Sylgard ajuda a cola cyanoacrylic aderir à tampa de deslizamento quando os vermes colagem para baixo e também atua como uma almofada sobre a qual a quebrar novamente a cola pipeta ponta quando se torna ligado. Sylgard é composta frescas de acordo com as instruções de fabrica (10 base de silicone partes para 1 parte agente de cura em peso). Uma pequena gota de Sylgard é então colocado em cada lamínula e manchada em todo usando uma borda lâmina de barbear para fazer uma superfície uniforme. O lamínulas revestido são colocados em grande plano recipientes cobertos e deixados em um forno de 65 ° graus durante a noite para a cura.
3. Pipetas: Normalmente, nós usamos o mesmo 1 milímetro de diâmetro exterior de filamentos de vidro de borosilicato para gerar as pipetas para worms colagem para baixo, fazendo incisões cutícula e gravação de músculos, utilizando um extrator de eletrodo. É aconselhável para puxar um pote de pipetas antes de tentar uma dissecção como esta etapa pode exigir várias trocas rápidas de pipetas.
4. Aplicador de cola: Glue é carregada e aplicada desde a ponta de uma pipeta de cola, pela boca de pressão. A pipeta de colagem é inserido em uma extremidade de um pedaço de 2 pés de tubos de polietileno com um diâmetro interno que coincide com o diâmetro externo do vidro pipeta (geralmente 1 mm). A outra extremidade do tubo possui um eppendorf ponteira, que atua como um pedaço na boca.
5. Extração de pipeta: As vísceras verme deve ser removido da cavidade verme uma vez que a incisão cutícula foi feita. Isto é conseguido com um pedaço de tubo ligado a uma ponteira eppendorf similar à de aplicação da cola, mas neste caso o vidro extração ponta da pipeta é quebrado para trás o suficiente para permitir ovos e vísceras para ser facilmente aspirados para fora da cavidade worm.

B. A dissecção

1. Na câmara de gravação de uma linha circular de cera caneta é desenhada perto do perímetro da secção a que uma lamínula Sylgard revestido é pressionado firmemente no local (Sylgard revestimento virado para cima). Esta linha de cera imobiliza o lamínula e impede a solução de gravação de vazar debaixo e desalojar a lamínula durante a dissecção e gravação. A câmara é então preenchido com solução de gravação extracelular e worms várias são colocados no centro usando uma picareta worm. Worms vai nadar em solução, no entanto com a prática, estes worms podem ser colados para baixo, sem quaisquer procedimentos adicionais, tais como de refrigeração para evitar o movimento. Durante a fase de treinamento, ele pode ajudar para a prática de worms colagem mutante em que a natação é prejudicada (como unc-31 mutantes).
2. Um recipiente de cola feita com uma tampa de PCR realizada em cera ou massa de modelar, é usado para manter um estoque de trabalho da cola cyanoacrylic. Pipetas cola com dimensões ponta semelhante ao pipetas de gravação (normalmente resistência ~ 4 megohms) são usados ​​para aplicar cola. Usando o aplicador de cola, uma pequena quantidade de cola é sugado para dentro da pipeta cola, usando o escopo de dissecação para visualizar a ponteira como a cola é sugado para cima.
3. A cola cyanoacrylic (HistoacrylBlue, Aesulap) polimeriza em contato com a solução de gravação extracelular, por isso é importante para manter a pressão positiva sobre a pipeta de cola quando entra a solução da câmara para evitar a cola de endurecimento e entupimento da pipeta. Assim que a pipeta cola é na solução de câmara, um fluxo pequeno, mas constante de cola deve ser aplicada sobre a superfície Sylgard sob pressão boca-controle para evitar entupimento. Se a pipeta torna-se conectado às vezes pode ser desbloqueado batendo a ponta no vidro Sylgard revestido. É recomendável que você pratique antes de tentar colar worms cola. Se você pode rotineiramente escrever seu nome na cola na Sylgard, com letras feitas de linhas mais finas do que a largura worms você está pronto para proceed para colagem a cutícula worm.
4. Para colar um verme, use pressão positiva para anexar uma pequena quantidade de cola para a cabeça ou a cauda do verme rapidamente e tirar o worm para baixo sobre a superfície Sylgard. Tentar anexar o worm perto do centro da câmara como worms colados muito próximo à borda será difícil de alcançar com pipetas de gravação. Em seguida, aplique um fluxo constante de cola ao longo da borda dorsal da cutícula do verme da penhora de partida, forçando o worm em uma posição C-com a vulva virado (para as gravações do músculo ventral). Eventuais lacunas nesta linha de cola devem ser preenchidos para que o worm é fortemente ligados, para evitar que o worm de destacar durante a etapa de incisão cutícula.
5. Para fazer a incisão cutícula, mudar para uma pipeta de dissecção de mão. Esta pipeta precisa ser mais acentuada do que a cola / gravação de pipetas e têm um eixo curto, resistente. Usando a maior ampliação, sobre o âmbito de dissecação, alinhar a pipeta paralelo ao eixo longitudinal do worm e insira a ponta sobre o ponto médio ao longo do worm (perto da vulva) fazer a incisão na interface cutícula / cola. Esta incisão libera a pressão hidrostática worms forçando os ovos e os intestinos para fora através do ponto de incisão. Continue cortando a cutícula para a cabeça do verme com um movimento de corte semelhante a abrir uma carta, até chegar à faringe. Mudar para a pipeta de extração a vácuo com os órgãos internos do worm. Depois de limpar a incisão, a cutícula aberta irá manter a sua forma cilíndrica. Use uma pipeta colagem fresco a ponto de solda da borda de corte da cutícula para baixo sobre a superfície Sylgard. É importante o uso de pontos de cola mínima nesta fase para evitar danos ou obscurecendo a NMJs.
   O nervo ventral músculos da parede cabo e corpo estão agora expostos.
6. Para remover a membrana basal que cobre a NMJs, chupam a solução de gravação extracelular da câmara e aplicar colagenase (0.4mg/ml na solução de gravação extracelular) por cerca de 10-20 segundos, remova e lave várias vezes com solução de gravação fresco extracelular. Passar à fase de gravação.

C. gravação de patch-clamp

1. Posição da câmara de gravação em um estágio do microscópio até a direita usando uma objetiva de 10X para o centro do worm. Mudar para um objectivo de água emersão-40X com DIC e verifique se os músculos do corpo de parede e cordão nervoso estão intactos. Posição o worm modo que o eixo longitudinal do worm é paralela com a borda frontal do escopo, permitindo que os eletrodos para ser introduzido a partir de ambos os lados esquerdo e direito.
2. Corrigir o músculo usando o padrão patch-fixação técnicas. Eletrodos de registro de cerca de resistência megohms 4 funcionam bem. Uma vez que o eletrodo toca a membrana muscular, aumento da pressão negativa, até um selo gigohm é obtido. Para o modo de gravação de célula inteira tensão-clamp, aplicar mais de sucção e zap da membrana até o selo gigohm é rompido. Em uma boa gravação, os músculos do corpo muro de worms tipo selvagem adultos normalmente têm uma capacitância da membrana da célula de pF ~ 70 e pode ser estavelmente gravado durante pelo menos 10 minutos em um potencial de realização de -60 mV com o mínimo de correntes de exploração (~ 50 pA).
3. A solução consiste em gravar extracelular (em mM): NaCl 150, KCl 5, CaCl ₂ 5, MgCl ₂ 4, glicose 10, sacarose 5, HEPES 15 (pH 7,3, 330mOsm ~). A pipeta patch contém (em mM): KCl 120, KOH 20, MgCl ₂ 4, (N-tris [Hidroximetil] mthyl-2-aminoetanotiol-ácido sulfônico) TES 5, Dihidratado CaCl ₂ 0,25, Na ₂ ATP 4, sacarose 36 , EGTA 5 (pH 7,2, ~ 312 mOsm). Nota: Estas soluções artificialmente carga células musculares com cloreto, de modo que o receptor GABA-mediada correntes são para dentro devido ao efluxo de cloreto em um potencial de realização de -60 mV. Variações sobre estas soluções têm sido utilizadas (ver publicações para detalhes).
4. Evocado lançamento. Normalmente coloca-se um segundo eletrodo contendo solução extracelular sobre a anterior ventral do nervo para o músculo cabo remendado. Esta configuração de patch solta requer grandes estímulos despolarizantes (da ordem de 10s de volts) de curta duração (1-2ms) para alcançar máxima respostas evocadas (tipicamente nA 2,0-2,5) no tipo selvagem worms. As limitações desta abordagem são: 1) Apenas algumas respostas evocadas pode ser entregue antes do cordão nervoso está irreversivelmente danificado e 2) Por razões desconhecidas, apenas colinérgicos respostas evocadas pode ser obtida usando esta configuração de estimulação.
5. Luz ativada canais rodopsina estimulação. Recentemente, o laboratório Gottschalk gerou worms transgênicos expressando derivado de algas rodopsinas canal que despolarizar a membrana sobre luz-estimulação em subconjuntos de neurônios, dependendo do promotor usado para acionar expressão ^4. No caso do C. elegans MNJ, linhas integradas expressar canal de rodopsina em ambos os neurônios motores colinérgicos ou neurônios motores GABAérgicos estão agora available. Desde canal rodopsina só responde a luz quando all-trans retinal é associado com a metade opsina, worms utilizado para esta aplicação deve ser cultivada em bactéria guarnecida com retina. Um pulso de luz verde pode então ser usada para ativar a rodopsina repetidamente canal causando a liberação evocada de qualquer ACh ou GABA, dependendo de qual vermes transgênicos são utilizados. Esses vermes transgênicos podem ser cruzadas em cepas mutantes. A vantagem desta técnica sobre a estimulação elétrica anteriores incluem: 1) Ativação por luz não causa danos neuronais, permitindo repetir muitos estímulos a serem executadas e 2) Evocados liberação de ambos os neurônios motores GABAérgicos ou colinérgicos podem ser independentemente estudados.
6. Hiperosmótico induzida por liberação. Para medir o tamanho do pool de vesículas prontamente liberável (refletindo a piscina resumiu de vesículas preparadas a partir de todos os do MNJ para o músculo gravada), a pressão da pipeta contendo solução extracelular hiperosmótico (ajustado para ~ mOsm 850 por adição de sacarose adicional) é usado. Pressão de pulso de aplicações de segundos 1-3 produzir uma barragem de assíncrona pós-sinápticos eventos usando as soluções padrão descrito acima.

Figura 1: Visão esquemática do C. elegans dissecção e configuração de gravação neuromuscular

A lamela Sylgard revestidos constituídos por uma queda de manchas de Sylgard através do vidro durante a noite e cura é colocado na cavidade circular da câmara de gravação pré-fabricadas e cobertas com solução de gravação. Um worm colocada no centro é colada à superfície Sylgard a partir da cabeça ou cauda, ​​aplicação de cola para o lado dorsal do worm, com uma pipeta, cola. Uma vez que a colagem está completa, uma incisão junto à vulva, na interface entre a cutícula e cola é feita com uma agulha de vidro e estendeu em direção à cabeça (ver linha perfurada vermelho). Após a extracção de vísceras e ovos da cavidade do corpo, a borda do corte da incisão é o ponto-soldados com cola à Sylgard expondo o nervo ventral (verde) e os músculos do corpo de parede (vermelho). O músculo ventro-medial anterior à vulva é patch-fixada eo eletrodo é colocado estimulando a montante sobre o cabo dos nervos.

Resultados representativos

De célula inteira, tensão muscular fixada corpo gravações de parede são mostrados para cada um dos três protocolos de estimulação descrito acima (eletricamente evocado, light-evocado e respostas hiperosmótico). Em todos os casos, o ventro-medial do músculo parede do corpo é fixada em -60 mV. Células A. Wild-musculares tipo geralmente apresentam altas taxas de endógenos em miniatura dentro correntes sinápticas nas nossas soluções de gravação padrão. B. A despolarização 2ms do cordão nervoso ventral anterior provoca a liberação síncrona de várias sinapses, resultando em uma grande resposta evocada de cerca de 2-2,5 nA no tipo selvagem worms. Traços representante para o direito dos traços do tipo selvagem, em A, B e mostrar liberação sináptica em um mutante severamente descoordenada (unc-18). Painel C mostra uma resposta clara evocadas a partir da junção neuromuscular de um verme selvagem expressar canal de rodopsina em neurônios colinérgicos. Um pulso de luz 2ms geralmente produz uma resposta de 1,5-1,8 nA. D. pressão de ejeção de 850 mOsm hiperosmótico salino sobre o músculo para 1s, produz uma barragem assíncrona de miniatura correntes sinápticas que representam a piscina prontamente liberável de vesículas.

Discussion

O modelo genético organismo C, elegans é ideal para o estudo da transmissão sináptica, através da análise funcional de mutações em genes que codificam proteínas sinápticas. Aqui nós descrevemos uma técnica de dissecção que torna o C. elegans NMJs acessíveis para análise eletrofisiológica. O vídeo que acompanha retrata as etapas críticas na C. elegans dissecção e da configuração da gravação típico usado para medir a atividade sináptica. As três etapas que representam os maiores desafios em aprender esta técnica são: 1) a etapa de colagem worm, 2) a realização de uma incisão bem sucedido, e 3) aplicação de patches para os músculos da parede do corpo. Uma vez que estes tenham sido dominados, esta preparação é propícia para a gravação do músculo pós-sinápticos em qualquer tensão de clamp ou pinça de corrente modos. Respostas aos estímulos evocados podem ser facilmente medidos utilizando esta preparação dissecada em uma variedade de origens mutantes. Dado o tamanho já minuto do verme adulto do tipo selvagem (1 mm de comprimento), mutantes sináptica que não atingem a idade adulta ou permanecer magro pode não ser favorável a esta abordagem dissecção. Os neurônios motores da medula nervosa ventral também são muito pequenas (M célula soma de 2-5) e colocam desafios adicionais para eletrofisiologistas, embora vários laboratórios com sucesso gravado a partir de C. neurônios elegans em variações da preparação dissecada aqui descritos ^{5 6.}