Disección y de grabación de la unión neuromuscular C. Elegans

Summary

Aplicación de la electrofisiología de las sinapsis accesibles proporciona una medida cuantificable de la actividad sináptica, útil en el análisis de mutantes sinápticos. Este artículo describe un método de disección utilizado para exponer la uniones neuromusculares (UNM) de

Abstract

Neurotransmisión es el proceso por el cual las neuronas de transferencia de información a través de señales químicas para su post-sináptica objetivos, en una escala de tiempo rápido. Este complejo proceso requiere la actividad coordinada de muchas proteínas pre-y post-sináptica para garantizar la conectividad sináptica adecuada, conducción de señales eléctricas, la orientación y el cebado de las vesículas secretoras, sensibles al calcio, la localización de las vesículas de fusión, y la función de los receptores postsinápticos y, finalmente, el reciclaje, mecanismos. Como los neurocientíficos es nuestra meta para dilucidar que las proteínas funcionan en cada uno de estos pasos y comprender sus mecanismos de acción. Registros electrofisiológicos de las sinapsis proporcionar una cuantificables lectura de los hechos subyacentes eléctricos que se producen durante la transmisión sináptica. Al combinar esta técnica con el poderoso conjunto de herramientas moleculares y genéticas disponibles para manipular las proteínas sinápticas en C. elegans, podemos analizar los cambios funcionales resultantes de la transmisión sináptica.

El C. elegans NMJs formado entre las neuronas motoras y los músculos de la pared del cuerpo de control de la locomoción, por lo tanto, los mutantes con fenotipos falta de coordinación locomotriz (conocido como unc s) a menudo la transmisión sináptica en estas perturbar ^una sinapsis. Desde mutantes unc se mantienen en una fuente rica de una fuente de alimento de bacterias, que siguen siendo viables, siempre que conservan la capacidad de bombeo de la faringe para ingerir alimentos. Esto, junto con el hecho de que C. elegans existen como hermafroditas, les permite pasar a la progenie mutante sin la necesidad de que las conductas de apareamiento más detalles. Estos atributos, junto con nuestra capacidad para grabar los últimos de los gusanos NMJs ^2,3,7 hacen de este organismo en un excelente modelo para abordar precisamente cómo unc neurotransmisión impacto mutantes.

El método de disección implica inmovilizar los gusanos adultos usando un pegamento cianoacrílico con el fin de hacer una incisión en la cutícula del gusano de la exposición del NMJs. Desde C. adultos elegans sólo 1 mm de longitud se realiza la disección con el uso de un microscopio de disección y requiere una excelente coordinación ojo-mano. Grabaciones MNJ se hacen de células enteras voltaje de sujeción individuales del cuerpo las células musculares de la pared y la liberación de neurotransmisores puede ser evocado mediante una variedad de protocolos de estimulación incluyendo la estimulación eléctrica, activado por la luz del canal-rodopsina mediada por la despolarización de ⁴ y solución salina hiperosmótico, todos los cuales se se describen brevemente.

Protocol

A. Preparación de las herramientas utilizadas para la disección.

1. La cámara de disección / grabación: Por lo general la construcción de nuestra cámara de grabación de un 1 / ¹⁶ de pulgada de hoja magnética, con un agujero circular perforado en el centro, que es lo suficientemente grande para dar cabida a un vaso de 22 mm de diámetro cubierta circular. Las dimensiones exteriores de la cámara dependerá de la platina del microscopio usado para hacer las grabaciones. En el reverso de la hoja magnética, se adjunta un 48 x 60 mm cubierta antideslizante, lo que nos adherimos a la cámara mediante la colocación de una bolita de cera de los tejidos de baja fusión Paraplax inserción en cada esquina de la hoja de cubierta colocada entre el cristal y la cámara . La cera se funde en un plato caliente, placa de cristal hacia arriba, hasta que se forme una capa continua pegando la hoja de la cubierta de la cámara. No deje este paso sin vigilancia ya que la cera se derrite rápidamente. La cámara se debe quitar y se enfría tan pronto como la cera se derrita. El exceso de cera que se ha filtrado a lo largo del borde interior de la cavidad circular de 22 mm se puede eliminar con una ventaja de hoja de afeitar.
2. Sylgard recubierto cubreobjetos: La disección se realiza en una de 22 mm, con recubrimiento Sylgard cubreobjetos que se coloca dentro de la cavidad circular de la cámara de grabación. La capa Sylgard ayuda a que el pegamento cianoacrílico se adhieren a la hoja de cubierta que pegar los gusanos hacia abajo y también actúa como un cojín sobre el que romper de nuevo el pegamento punta de la pipeta cuando se tapa. Sylgard está compuesta por frescos de acuerdo a las instrucciones del fabricante (10 piezas base de silicona y 1 parte de endurecedor por peso). Una pequeña gota de Sylgard se coloca en cada hoja de la cubierta y se unta todo con un borde de una hoja de afeitar para hacer una superficie uniforme. El cubreobjetos recubiertos se colocan en grandes recipientes planos cubiertos y se fue en un horno de grado 65 º durante la noche para curar.
3. Pipetas: Por lo general, se utiliza el mismo filamento de 1 mm de diámetro exterior de vidrio de borosilicato para generar las pipetas para los gusanos pegando, haciendo incisiones cutícula y el registro de los músculos, con un extractor de electrodos. Es aconsejable sacar un frasco de pipetas antes de intentar una disección de esta etapa puede requerir varios intercambios rápidos de las pipetas.
4. Aplicador de cola: cola se carga y se aplica desde la punta de una pipeta de goma, por boca de presión. La pipeta pegado se inserta en un extremo de una pieza de 2 pies de tubería de polietileno con un diámetro interior que coincide con el diámetro exterior de la pipeta (generalmente de 1 mm). El otro extremo de la tubería tiene una punta de pipeta eppendorf que actúa como un pedazo de la boca.
5. Extracción de pipeta: Las vísceras gusano debe ser retirado de la cavidad del gusano una vez que la incisión de la cutícula se ha hecho. Esto se logra con un pedazo de tubo conectado a una punta de pipeta eppendorf similar al aplicador de cola pero en este caso la extracción de vidrio punta de la pipeta se rompe lo suficiente para que los huevos y las vísceras para ser fácilmente aspirado fuera de la cavidad del gusano.

B. La disección

1. En la cámara de grabación de una línea de cera de corral circular se extrae cerca del perímetro de la cámara a la que se pulsa una hoja de cubierta Sylgard recubiertos firmemente en su lugar (Sylgard capa hacia arriba). Esta línea de cera inmoviliza la hoja de la cubierta e impide la solución de grabación se filtre por debajo y se desprenda de la hoja de la cubierta durante la disección y la grabación. La cámara se llena con una solución de registro extracelular y varios gusanos se colocan en el centro con un pico del gusano. Los gusanos nadar en solución, sin embargo con la práctica, estos gusanos pueden ser pegados sin ningún tipo de procedimientos adicionales, tales como refrigeración para evitar el movimiento. Durante la etapa de entrenamiento, puede ayudar a la práctica los gusanos pegado mutante en el que la natación es afectada (por ejemplo, unc-31 mutantes).
2. Un recipiente de pegamento hecho con una tapa de PCR realizada en cera o plastilina, se utiliza para mantener un stock de trabajo de la cola cianoacrílico. Pipetas de cola con punta de dimensiones similares a las pipetas de grabación (normalmente ~ 4 megohmios de resistencia) se utilizan para aplicar el pegamento. Usando el aplicador de cola, una pequeña cantidad de pegamento es absorbida en la pipeta de pegamento, con el alcance de disección para visualizar la punta de la pipeta como el pegamento es absorbido.
3. El pegamento cianoacrílico (HistoacrylBlue, Aesulap) se polimeriza en contacto con una solución de registro extracelular, por lo tanto es importante mantener la presión positiva en la pipeta de cola, ya que entra en la solución de la cámara para evitar que el pegamento se endurezca y tapar la pipeta. Tan pronto como la pipeta de cola es en la solución de cámara, un flujo pequeño pero constante de pegamento debe ser aplicado sobre la superficie Sylgard bajo el control de la boca de presión para evitar el taponamiento. Si la pipeta se tapa a veces puede ser desbloqueado por golpeando suavemente la punta en el cristal Sylgard recubiertos. Se recomienda que la práctica antes de intentar pegar a los gusanos de goma. Si habitualmente puede escribir su nombre en la cola en el Sylgard, con letras hechas de líneas más finas que el ancho de los gusanos que están listos para procid a pegar la cutícula del gusano.
4. Para pegar un gusano, el uso de presión positiva para adjuntar una pequeña cantidad de pegamento ya sea a la cabeza o la cola del gusano y el gusano dibujar rápidamente hacia la superficie Sylgard. Tratar de unir el gusano cerca del centro de la cámara como los gusanos pegados demasiado cerca del borde será difícil de alcanzar con pipetas de grabación. A continuación, aplicar una corriente constante de pegamento en el borde dorsal de la cutícula de los gusanos de la unión de partida, obligando al gusano en un C-posición con la vulva hacia adentro (para las grabaciones de los músculos ventrales). Las lagunas en esta línea de cola se debe llenar en lo que el gusano está fuertemente unido, para evitar que el gusano se desprenda durante el paso de la incisión cutícula.
5. Para hacer la incisión cutícula, cambiar a una pipeta de disección de mano. Esta pipeta debe ser más agudo que el pegamento / grabación de las pipetas y tener un mango corto y robusto. Utilizando la más alta de aumento en el microscopio de disección, alinear la pipeta en paralelo al eje longitudinal del gusano e inserte la punta sobre el punto medio a lo largo del gusano (cerca de la vulva) de hacer la incisión en la interfaz de la cutícula / pegamento. Esta incisión libera la presión hidrostática gusanos obligando a los huevos y los intestinos a través del punto de incisión. Seguir reduciendo la cutícula hacia la cabeza del gusano con un movimiento de corte similar a la apertura de una carta, hasta llegar a la faringe. Cambiar a la pipeta de extracción al vacío de los órganos internos del gusano. Después de limpiar la herida, la cutícula abierta mantendrá su forma cilíndrica. Utilice una pipeta pegado fresco para la soldadura por puntos el borde del corte de la cutícula hacia abajo sobre la superficie Sylgard. Es importante utilizar un mínimo de puntos de pegamento en esta etapa para evitar dañar u ocultar los NMJs.
   La ventral del nervio espinal y músculos de la pared del cuerpo están expuestos.
6. Para quitar la membrana basal que cubre el NMJs, chupar la solución de grabación extracelular de la cámara y aplicar la colagenasa (0.4mg/ml en una solución de registro extracelular) durante unos 10-20 segundos, retirar y lavar varias veces con una solución fresca registro extracelular. Pasar a la etapa de grabación.

C. patch-clamp grabación

1. Posición de la cámara de grabación en una platina del microscopio a la derecha con un objetivo de 10X para centrar el gusano. Cambiar a un 40X agua emersión objetivo con coagulación intravascular diseminada y comprobar que los músculos de la pared del cuerpo y el cordón nervioso están intactas. La posición del gusano de modo que el eje longitudinal del gusano es paralelo con el borde frontal del ámbito de aplicación, lo que permite que se introduzcan electrodos en ambos lados de la izquierda y la derecha.
2. Parche con el músculo de sujeción estándar parche técnicas. Electrodos de registro de alrededor de 4 resistencia megaohmios funcionan bien. Una vez que el electrodo toca la membrana muscular, aumento de presión negativa hasta que un sello gigohm se obtiene. Para el modo de grabación de células enteras voltaje-clamp, aplicar más de succión y zap la membrana hasta que el sello está roto gigohm. En una buena grabación, los músculos del cuerpo de la pared de los gusanos adultos de tipo salvaje suelen tener una capacidad de la membrana celular de ~ 70 pF y puede ser registrado en forma estable al menos 10 minutos en un potencial de -60 mV con un mínimo de corrientes de retención (~ 50 pA).
3. La solución se compone de registro extracelular (en mM): NaCl 150, KCl 5, _CaCl2 5, MgCl ₂ 4, 10 glucosa, sacarosa 5, HEPES 15 (pH 7,3, 330mOsm ~). La pipeta parche contiene (en mM): KCl 120, KOH 20, MgCl ₂ 4, (N-tris [hidroximetil]-2-mthyl aminoetano-sulfónico) TES 5, dihidrato _CaCl2 0,25, Na ₂ 4 ATP, sacarosa 36 , EGTA 5 (pH 7,2, ~ 312 mOsm). Nota: Estas soluciones de carga artificialmente las células musculares con cloruro, por lo que el GABA mediada por los receptores de corrientes hacia el interior debido a la emanación de cloruro en un potencial de -60 mV. Variaciones sobre estas soluciones se han utilizado (ver las publicaciones para más detalles).
4. Evocó la liberación. Normalmente se coloca un segundo electrodo que contiene la solución extracelular en la parte anterior del nervio cordón ventral del músculo parcheado. Esta configuración parche suelto requiere grandes estímulos despolarizantes (del orden de 10 segundos de voltios) de corta duración (1-2ms) para lograr la máxima respuestas evocadas (normalmente 2,0-2,5 nA) de tipo salvaje gusanos. Las limitaciones de este enfoque son: 1) Sólo un reducido número de respuestas evocadas pueden ser entregados antes de que el cordón nervioso está irreversiblemente dañado y 2) Por razones desconocidas, sólo respuestas colinérgicas evocado puede ser obtenido con esta configuración de estimulación.
5. La luz activa el canal-rodopsina estimulación. Recientemente, el laboratorio ha generado Gottschalk gusanos transgénicos que expresan las algas de origen rodopsinas canal que despolarizar la membrana a la luz de la estimulación de los subgrupos de neuronas, según el promotor utilizado para dirigir la expresión ^4. En el caso de la C. elegans UNM, líneas de expresión de los canales integrados rodopsina, ya sea en las neuronas motoras colinérgicas o neuronas GABAérgicas del motor están dise. Desde el canal de la rodopsina sólo responde a la luz cuando todo-trans retinal se asocia con el resto opsina, gusanos utilizan para esta aplicación deben ser cultivados en las bacterias mezclada con la retina. Un pulso de luz verde se puede utilizar para activar repetidamente el canal de la rodopsina causando la liberación evocada de cualquiera de ACh o GABA, en función de que los gusanos transgénicos se utilizan. Estos gusanos transgénicos se puede cruzar en las cepas mutantes. La ventaja de esta técnica sobre la estimulación eléctrica anteriores incluyen: 1) La luz de activación no causa daño neuronal, lo que permite la repetición de muchos estímulos para llevar a cabo y 2) Evocados liberación de cualquiera de las neuronas GABAérgicas de motor o colinérgicos puede ser independiente de estudio.
6. Hiperosmótico inducida por la liberación. Para medir el tamaño de la piscina de la vesícula fácilmente pueden soltar (que refleja la piscina suma de las vesículas preparadas de todo el MNJ en el músculo registrada), de presión a la pipeta con solución hiperosmótico extracelular (ajustado a ~ 850 mOsm por adición de sacarosa adicional) se utiliza. La presión de pulso de aplicaciones de 1-3 segundos produce un aluvión de asíncrono post-sináptica eventos utilizando las soluciones estándar descrito anteriormente.

Figura 1: Esquema de la C. elegans la disección y la configuración de la grabación neuromuscular

Un cubreobjetos Sylgard recubiertas que estén hechas por colocación de una gota de Sylgard a través del vidrio y curado durante la noche se coloca en la cavidad circular de la cámara de registro prefabricados y cubiertas con una solución de grabación. Un gusano coloca en el centro está pegado a la superficie Sylgard a partir de la cabeza o la cola, la aplicación de pegamento en la cara dorsal del gusano, utilizando una pipeta de goma,. Una vez pegado se ha completado, una incisión adyacente a la vulva, en la interfase entre la cutícula y la cola se realiza con una aguja de vidrio y se extendió hacia la cabeza (ver la línea perforada de color rojo). Tras la extracción de las vísceras y los huevos de la cavidad del cuerpo, el borde del corte de la incisión es soldada por puntos con pegamento a la Sylgard exponer el nervio ventral (verde) y los músculos del cuerpo de la pared (en rojo). El músculo ventral-medial anterior de la vulva es patch-pinza y el electrodo de estimulación se coloca arriba en el cordón nervioso.

Los resultados representativos

De células enteras, la tensión de los enganches del cuerpo grabaciones músculo de la pared se muestran para cada uno de los tres protocolos de estimulación se ha descrito anteriormente (evocada eléctricamente, la luz y las respuestas evocadas hiperosmótico). En todos los casos el músculo ventral del cuerpo-medial de la pared se fija a -60 mV. A. de tipo salvaje células musculares por lo general exhiben altas tasas de corrientes hacia el interior endógeno en miniatura sináptica en nuestras soluciones de grabación estándar. B. A la despolarización de 2ms del cordón nervioso ventral anterior provoca la liberación sincrónica de varias sinapsis que resulta en una gran respuesta de alrededor de 2-2.5 provocado nA de tipo salvaje gusanos. Rastros representante a la derecha de la traza de tipo salvaje en A y B muestran liberación sináptica en una grave falta de coordinación mutante (UNC-18). El panel C muestra una respuesta a la luz-evocada de la unión neuromuscular de un gusano de tipo salvaje expresar canal rodopsina en las neuronas colinérgicas. Un pulso de luz de 2 ms típicamente produce una respuesta de 1,5 a 1,8 nA. D. La presión de eyección de la solución salina 850 mOsm hiperosmótico en el músculo durante 1 segundo, produce una descarga asincrónica de las corrientes sinápticas en miniatura que representan a la piscina con facilidad-liberable de vesículas.

Discussion

La genética organismo modelo C elegans es ideal para el estudio de la transmisión sináptica, a través del análisis funcional de las mutaciones en genes que codifican las proteínas sinápticas. Aquí se ha descrito una técnica de disección que hace que el C. elegans NMJs accesible para el análisis electrofisiológico. El video que acompaña describe los pasos críticos en el C. elegans disección y la configuración de grabación típico utilizado para medir la actividad sináptica. Los tres pasos que plantean los mayores desafíos en el aprendizaje de esta técnica son: 1) el paso de pegar gusano, 2) la realización de una incisión de éxito, y 3) de parches a los músculos del cuerpo de la pared. Una vez que estas han sido dominadas, esta preparación es susceptible a la grabación del músculo post-sináptica, ya sea en el voltaje-clamp o modos de corriente-clamp. Respuestas a los estímulos evocados se pueden medir fácilmente utilizando esta preparación disecada en una variedad de mutantes antecedentes. Dado el tamaño ya minutos del gusano adulto de tipo salvaje (1 mm de longitud), los mutantes sinápticos que no alcanzan la edad adulta o permanecer flacos no pueden ser susceptibles de este método de disección. Las neuronas motoras de la médula ventral del nervio también son muy pequeños (2-5 células soma m) y plantean retos adicionales para los electrofisiólogos, aunque varios laboratorios se han registrado con éxito a partir de C. elegans neuronas en las variaciones de la preparación disecada se describe aquí ^{5 6.}