C. Elegans Nöromüsküler Kavşağı Diseksiyon ve kayıt

Summary

Erişilebilir sinaps elektrofizyoloji Uygulama sinaptik mutantlar analiz yararlı sinaptik aktivite ölçülebilir bir ölçü, sağlar. Bu makale, nöromüsküler kavşaklar (NMJ) ortaya çıkarmak için kullanılan bir diseksiyon yöntemi açıklar

Abstract

Nörotransmisyon nöronların hızlı bir zaman ölçeğinde, post-sinaptik hedeflere kimyasal sinyaller aracılığı ile bilgi aktarımı sürecidir. Bu karmaşık bir süreç uygun sinaptik bağlantı, elektrik sinyallerinin iletim, hedeflemesi ve sekretuar veziküller, kalsiyum algılama, vezikül füzyon, yerelleştirme ve postsinaptik reseptörler fonksiyonu emişli sağlamak için çok sayıda pre-ve post-sinaptik proteinlerin koordineli faaliyet gerektirir ve nihayet, geri dönüşüm mekanizmaları. Sinirbilimciler olarak bu adımların her biri işlevi gören proteinler aydınlatmak ve eylem mekanizmaları anlamak için bizim hedefimizdir. Sinapsların elektrofizyolojik kayıtlar sinaptik iletimi sırasında meydana gelen elektriksel olayların altında yatan okumak ölçülebilir sağlar. Moleküler ve genetik araçlar güçlü dizisi ile C sinaptik proteinlerin işlemek için bu tekniği birleştirerek elegans, sinaptik iletim meydana gelen fonksiyonel değişiklikler analiz edebilirsiniz.

C. elegans motor nöronlar ve vücut duvarı kasları kontrol hareket, bu nedenle, bu sinaps ¹ koordinasyonsuz lokomotor fenotipleri (unc olarak da bilinir) ile mutantları sık sık karıştırmayı sinaptik iletim arasında oluşan NMJs. Unc mutantlar bakteriyel bir besin kaynağı zengin bir kaynağı muhafaza olduklarından, yemek yedikten bazı faringeal pompalama yeteneği korumak gibi uzun süre canlı kalır. Bu gerçeği ile birlikte bu C. elegans çift cinsiyetli olarak var, onları ayrıntılı çiftleşme davranışları gerek kalmadan mutant döl geçmesine izin verir. Bu öznitelikler, son NMJs ^2,3,7 tam olarak nasıl unc mutantlar etkisi nörotransmisyon adresi olan bu mükemmel bir model organizma solucanlar kayıt yeteneği ile birleştiğinde.

Diseksiyon yöntemi cyanoacrylic NMJs açığa solucan manikür bir kesi yapmak için bir yapıştırıcı kullanarak erişkin solucanlar hareketsizleştirir içerir. C. yılından bu yana elegans yetişkin diseksiyon diseksiyon mikroskop kullanımı ile gerçekleştirilen ve mükemmel el-göz koordinasyonu gerektiren sadece 1 mm uzunluğunda. NMJ kayıtları, tüm hücre sıkma bireyin vücut duvarı kas hücreleri ve nörotransmitter serbest voltaj elektrik stimülasyonu, ışık ile aktive olan kanal rodopsin aracılı ^{depolarizasyon} 4 ve olacak bütün bunlar Hiperozmatik tuzlu su da dahil olmak üzere çeşitli stimülasyon protokolleri kullanarak uyarılmış olabilir tarafından yapılır kısaca açıklanmıştır.

Protocol

Diseksiyon için kullanılan aletler, A. hazırlanması.

1. Diseksiyonu / kayıt oda: Biz genellikle, 22 mm çapında yuvarlak cam kapak barındıracak kadar büyük olduğunu merkezi haline delinmiş dairesel bir delik ile, 1 / ¹⁶ th inç manyetik levha bizim kayıt odasına oluşturmak . Odanın dış boyutları kayıtları yapmak için kullanılan mikroskop sahne bağlıdır. Manyetik sac ters tarafta, kapağın her köşesinde düşük erime Paraplax doku gömme balmumu bir pelet koyarak odasına bağlı 48 x 60 mm kapak kayma, takmak cam ve oda arasında sıkışmış slip . Sürekli bir kat yapıştırma odasına kapak kayma oluşturur kadar mum sonra, cam levha yukarı bakacak şekilde, sıcak bir plaka üzerinde eritilir. Balmumu çabuk erir gibi bu adımı yalnız bırakmayın. Odasına kaldırıldı ve balmumu eriyene gibi kısa sürede soğutulması gerekmektedir. 22mm yuvarlak boşluğunun iç kenarı boyunca seeped Fazla balmumu bir jilet kenar kullanarak silinebilir.
2. Sylgard kaplı kapak fişleri: diseksiyonu ise 22 mm, kayıt odasının dairesel boşluğu içinde yer almakta olup Sylgard kaplı kapak kayma yapılır. Sylgard kat cyanoacrylic tutkal aşağı ve solucanlar bu takılı olduğunda tutkal pipet geri kırmak için bir yastık görevi görür yapıştırma kayma kapağı için uygun yardımcı olur. Sylgard göre taze yapılır talimatları (10 parça silikon taban 1 kilo ajan kür parçası) üretmektedir. Sylgard küçük bir damla, sonra her kapak astar üzerine yerleştirilir ve düz bir yüzey yapmak için jilet kenarı kullanılarak boyunca lekelenmiş. Kaplamalı kapak fişleri büyük düz kapalı kaplarda yerleştirilir ve tedavi için bir gecede 65 ° derece fırında bırakılır.
3. Pipetler: Tipik olarak, bir elektrot çektirmenin kullanarak, kaslar kütikula kesiler ve kayıt yapma, aynı 1 mm dış çapı filament borosilikat camdan aşağı yapıştırma solucanlar için pipetler oluşturmak için kullanan. Bu aşamada, pipetler çok hızlı bir değişim gerektiren bir diseksiyon denemeden önce pipetler bir kavanoza çekmek için tavsiye edilir.
4. Tutkal aplikatör: Tutkal yüklü ve ağız basıncı ile, bir tutkal pipet ucu uygulanır. Yapıştırma pipet pipet cam (genellikle 1 mm), dış çapı eşleşen bir iç çapı ile polietilen boru, 2 ayak parçasının bir ucunu eklenir. Hortumun diğer ucunda, bir ağız parçası olarak hareket eden bir Eppendorf pipet tutar.
5. Ekstraksiyon pipet: kütikül kesi yapıldıktan sonra solucan organlar solucan boşluğu uzaklaştırılmalıdır. Bu boru tutkal benzeri bir Eppendorf pipet bağlı, ancak bu durumda cam çıkarma pipet solucan boşluğuna yumurta ve iç organları dışarı vakumlu kolayca izin için yeterince geri kırık bir parça ile sağlanır.

B. disseksiyonu

1. Kayıt odasında dairesel bir balmumu kalem hattı Sylgard kaplı bir kapak kayma sıkıca basıldığında odası (Sylgard kat yukarı bakacak şekilde) çevresine yakın çizilir. Bu balmumu hat kapak kayma durduran ve kayıt altında sızan ve diseksiyon ve kayıt sırasında kapak kayma yerinden oynatmamaya çözümü engeller. Odasına sonra ekstrasellüler kayıt çözümü ile doludur ve çeşitli solucanları bir solucan almak kullanarak yerleştirilir. Worms çözüm yüzmek, ancak uygulama ile bu solucanlar aşağı hareket etmesini önlemek için soğutma gibi başka prosedürler olmaksızın yapıştırılmış olabilir. Eğitim aşamasında, yüzme engelli olduğu yapıştırma mutant solucanlar (unc-31 mutantlar gibi) uygulamaya yardımcı olabilir.
2. PCR kap, mum veya modelleme kilden yapılan bir moda bir tutkal kabı, cyanoacrylic tutkal çalışan bir stok tutmak için kullanılır. Tutkal pipetler kayıt pipetler benzer uç boyutları ile (normalde ~ 4 megohms direnç) zamk uygulamak için kullanılır. Tutkal, yapıştırıcı aplikatör kullanarak küçük bir miktar yapıştırıcı emilir pipet görselleştirmek için diseksiyon kapsamı kullanarak, tutkal pipet içine emilir.
3. Cyanoacrylic tutkal (HistoacrylBlue, Aesulap) ekstraselüler bir kayıt çözümü ile temas polimerize, bu nedenle sertleştirme tutkal önlemek ve pipet takmayı tutkal pipet pozitif basınç odası çözüm girerken muhafaza etmek önemlidir. En kısa sürede tutkal pipet oda çözümü olduğu gibi, küçük fakat sürekli bir tutkal takmayı önlemek için ağız basıncı kontrol altında Sylgard yüzeyine uygulanması gerekir. Pipet olursa bazen sylgard kaplı cam ucu hafifçe dokunarak serbest olabilir takılı. Bu tutkal solucanlar denemeden önce yapıştırma pratik tavsiye edilir. Rutin, Sylgard yapıştırıcı, solucanlar genişliğinden daha ince çizgiler yapılan harflerle adınızı yazmak durumunda proc hazıryapıştırma solucan manikür eed.
4. Bir solucan tutkal için, pozitif basınç, baş veya solucan kuyruk ya küçük bir miktarda tutkal takmak için kullanın ve solucan Sylgard yüzeye hızla aşağı çekecek. Solucanlar kenarına çok yakın kayıt pipetler ile ulaşmak zor olacaktır yapıştırılmış olarak odasının merkezine yakın solucan eklemek deneyin. Sonra, vulva (ventral kas kayıtları için) içe bakan ile bir C-pozisyon içine solucan zorlayarak, sabit bir başlangıç ​​eklenti solucan manikür, dorsal kenarı boyunca tutkal akımı uygulanır. Bu tutkal doğrultusunda herhangi bir boşluk solucan güçlü bir solucan kütikula kesi adım sırasında koparmasını engellemek için, bağlı olduğu o kadar dolu olmalıdır.
5. Kütikula kesi yapmak için, elde tutulan bir diseksiyon pipet geçmek. Bu pipet tutkal / kayıt pipetler daha keskin ve kısa, sağlam bir şaft var. Diseksiyon kapsamı yüksek büyütmeli kullanarak, solucanın uzunlamasına eksenine paralel pipet hizalayın ve manikür / tutkal arayüzü kesi solucan (vulva yakın) boyunca orta noktası hakkında ipucu eklemek. Bu kesi kesi noktası üzerinden yumurta ve bağırsakların dışarı atarken solucanları hidrostatik basınç serbest bırakır. Farinks ulaşana kadar, bir mektup açılışına benzer bir dilimleme hareketi ile solucanın baş doğru manikür kesme devam edin. Solucanın iç organları dışarı vakum ekstraksiyon pipet üzerinden geçin. Kesi temizledikten sonra, açılan manikür silindir şeklinde sürdürecek. Sylgard yüzeye manikür kesme kenarından aşağı kaynak nokta taze bir yapıştırma pipet kullanın. NMJs zarar veya alanını kapatmasını engellemek için bu aşamada en az yapıştırıcı noktalar kullanmak önemlidir.
   Ventral sinir kablosu ve vücut duvarı kasları maruz kalmaktadır.
6. NMJs kapsayan bazal membran kaldırmak odasından ekstraselüler kayıt çözümü emmek ve 10-20 saniye için kollajenaz (ekstrasellüler kayıt çözümü 0.4mg/ml) uygulamak için; kaldırmak ve taze ekstraselüler kayıt çözümü ile birkaç kez yıkayın. Kayıt aşamasına geçin.

C. Patch-kelepçe kayıt

1. Solucan merkezi bir 10X objektif kullanarak bir yukarı doğru mikroskop sahnede kayıt odasına yerleştirin. DIC ile 40X su emersion amacı geçin ve vücut duvarı kasları ve sinir kablosu sağlam olup olmadığını kontrol edin. Solucan solucan boylamasına ekseni, elektrotlar, her ikisi de sağ ve sol taraftan tanıtılacak izin kapsamı ön kenarı ile paralel olacak şekilde yerleştirin.
2. Yama standart yama klemp teknikleri kullanarak kas. Yaklaşık 4 megohms direnç Kayıt elektrotlar iyi çalışır. Kas membran elektrot dokunduğunda gigohm mühür elde edilinceye kadar, negatif basınç artar. Tam hücreli gerilim kelepçe kayıt modu için, daha fazla emiş uygulamak ve membran zap gigohm mühür rüptüre kadar. İyi bir kayıt, yabani tip erişkin solucanlar vücut duvarı kasları genellikle bir hücre zarı ~ 70 pF kapasitans var ve istikrarlı bir şekilde en az 10 dakika süreyle asgari tutan akımları (~ 50 -60 mV bir holding potansiyeli kaydedilebilir PA).
3. NaCl 150, KCl 5, CaCl ₂ 5, MgCl ₂ 4 10, glikoz, sakkaroz 5, HEPES 15 (pH 7.3 ~ 330mOsm): ekstraselüler kayıt çözümü (mM) oluşur. Yama pipetle (mM) içerir: KCl 120, KOH 20, MgCl ₂ 4, TES 5 (N-tris [hydroxymethyl] mthyl-2-aminoethane-sülfonik asit), Dihidrat CaCl ₂ 0.25, Na ₂ ATP 4, sakaroz 36 EGTA 5 (pH: 7.2 ~ 312 mOsm). Not: Bu çözümler yapay GABA reseptör-aracılı akımları içe tutma potansiyeli -60 mV klorür efflux nedeniyle, böylece klorür ile kas hücreleri yük. Bu çözümler Üzerine Çeşitlemeler (Detaylar için yayın bakınız) kullanılmıştır.
4. Serbest Uyarılmış. Genelde biz yamalı kas ventral sinir kord anterior ekstrasellüler çözüm içeren ikinci bir elektrot yerleştirin. Bu gevşek yama yapılandırma yabani tip solucanlar maksimum uyarılmış yanıtlar (genellikle 2,0-2,5 nA) elde etmek için, kısa bir süre büyük depolarizan uyaranlara (volt 10s sırasını) (1-2ms) gerektirir. Bu yaklaşımın sınırlamaları şunlardır: 1) Sadece birkaç uyarılmış yanıtlar, sinir kablosunu geri dönüşümsüz hasar ve 2 önce bilinmeyen nedenlerden dolayı teslim edilebilir), sadece kolinerjik uyarılmış yanıtlar bu uyarımı yapılandırmayı kullanarak elde edilebilir.
5. Işık kanal rodopsin stimülasyon aktif. Son zamanlarda, Gottschalk laboratuvar ifade alg türetilmiştir ifade ⁴ sürmek için kullanılan promotor bağlı olarak, nöronlar altkümelerini ışık stimülasyon üzerine membran depolarize kanal rhodopsins. Transgenik solucanlar üretti C durumda elegans NMJ, ya Kolinerjik motor nöron veya GABAerjik motor nöronların kanal rodopsin ifade entegre hatları şimdi available. Kanal rodopsin sadece retina all-trans opsin benzer parçaları ile ilişkili olduğu zaman ışık yanıt, bu uygulama için kullanılan solucanlar retina bezenmiş bakterilerin yetiştirilmesi gerekir. Yeşil ışık nabız sonra sürekli olarak transgenik solucanlar olduğuna bağlı ACh veya GABA ya da uyarılmış salınmasına neden olur kanal rodopsin etkinleştirmek için kullanılabilir. Bu transgenik solucanlar mutant önüne geçilebilir. Önceki elektrik stimülasyonu üzerinde bu tekniğin avantajı; 1) Işık etkinleştirme GABAerjik veya kolinerjik motor nöronların bağımsız olarak incelenebilir ya da serbest Uyarılmış), birçok tekrar uyarılar yapıldı ve 2 sağlayan nöronal hasara neden değildir.
6. Hiperozmotik kaynaklı serbest. Kolay-açıklanmaması vezikül havuzu (tüm NMJ Kullanıcı kaydedilen kas üzerine astarlanmalıdır veziküller özetlenebilir havuzu yansıtan), kullanılan Hiperozmatik ekstrasellüler çözüm (ek sakaroz ekleyerek ~ 850 mOsm ayarlanabilir) içeren bir basınç-pipet boyutunu ölçmek için. 1-3 saniye Basınç darbe uygulamaları, yukarıda açıklanan standart çözümleri kullanarak asenkron post-sinaptik olaylar bir baraj üretir.

Şekil 1: C. şematik bir bakış elegans diseksiyon ve nöromüsküler kayıt yapılandırma

Sylgard kaplı lamel bulaşması cam ve kür boyunca Sylgard bir damla tarafından yapılan gecede prefabrik kayıt odasının dairesel boşluğuna yerleştirilen ve kayıt çözümü ile kaplıdır. Merkezinde yerleştirilen bir solucan, baş veya kuyruk itibaren solucanın dorsal tarafına tutkal uygulayarak bir yapıştırıcı pipet kullanarak Sylgard yüzeye yapıştırılır. Bir kez yapıştırma, manikür ve yapıştırıcı arasında arayüz bir cam iğne ile yapılır ve baş (kırmızı Delikli çizgi) doğru uzatılmış, vulva bitişik bir kesi tamamlandıktan. Iç organları ve vücut boşluğunda yumurta çıkarılması ardından, kesi kesme kenarı nokta-ventral sinir (yeşil) ve vücut duvarı kasları (kırmızı) açığa Sylgard tutkal kaynaklı. Vulva ön ventral-medial kas yama kenetli ve sinir kablosu üzerinden yukarı uyarıcı elektrot yerleştirilir.

Temsilcisi sonuçları

Tüm hücre, gerilim kenetli vücut duvarı kas kayıtları, her biri için (elektriksel olarak uyarılmış, ışık-uyarılmış ve Hiperozmatik yanıtları) yukarıda açıklanan üç stimülasyon protokolleri gösterilmiştir. Tüm vakalarda ventral medial vücut duvarı kas -60 mV kelepçelenir. A. Wild-tip kas hücreleri genellikle standart kayıt çözümleri endojen içe minyatür sinaptik akımları yüksek oranlarda sergilerler. B. ön ventral sinir kablosunun 2ms depolarizasyon 2-2.5 civarında yabani tip solucanlar nA büyük bir uyarılmış yanıt ile sonuçlanan çeşitli sinapsların senkron salınımına neden olur. A ve B yabani tip izleri, sağ Temsilcisi izleri ciddi koordinasyonsuz bir mutant (unc-18) sinaptik serbest göstermektedir. Panel C kolinerjik nöronlar kanal rodopsin ifade eden bir yabani tip solucanın nöromüsküler kavşak bir ışık uyarılmış yanıt gösterir. A 2ms ışık nabız genellikle 1.5-1.8 nA bir tepki üretir. D. 1s için kas üzerine 850 mOsm Hiperozmatik tuzlu su basıncı ejeksiyon veziküllerin kolay açıklanmaması havuzu temsil eden minyatür sinaptik akımlarının bir asenkron baraj üretir.

Discussion

Genetik model organizmanın C, elegans ideal sinaptik proteinleri kodlayan genlerdeki mutasyon fonksiyonel analizi yoluyla, sinaptik iletim çalışması için uygundur. Burada C. işleyen bir diseksiyon tekniği tarif elegans elektrofizyolojik analizi için erişilebilir NMJs. Ekteki video C. kritik adımlar gösteriyor elegans diseksiyon ve sinaptik aktivitesini ölçmek için kullanılan tipik bir kayıt yapılandırma . Bu tekniği öğrenmeye büyük zorluklar teşkil üç adım; 1) solucan yapıştırma adım, 2), başarılı bir kesi performans ve vücut duvarı kasları 3) yama. Bu hakim edildikten sonra, bu hazırlık, ya da voltaj kelepçe veya akım kelepçe modları post-sinaptik kas kayıt mükellef. Bu mutant geçmişleri çeşitli disseke hazırlık kullanarak uyarılmış uyaranlara verilen yanıtlar kolayca ölçülebilmektedir. Yabani tip yetişkin solucan (1 mm uzunluğunda) zaten dakika büyüklüğü göz önüne alındığında, yetişkinlik ulaşmak, ya da cılız kalmaz sinaptik mutantlar bu diseksiyon yaklaşım uygun olmayabilir. Ventral sinir kablosu motor nöronlar birkaç laboratuvarları başarıyla C kaydedilmiş olmasına rağmen, aynı zamanda çok küçük (hücre soma 2-5 mikron) ve ek zorluklar electrophysiologists poz Burada disseke hazırlık varyasyonları elegans nöronlar ^{5 6} nitelendirdi.