Summary
היכולת למדוד את הקינטיקה של שחרור שלפוחית יכול לעזור לספק תובנה כמה יסודות עצבית. כאן השתמשנו בזמן אמת הדמיה של שלפוחית שכותרתו עם צבע אדום ניאון FM 4-64 למדוד את קצב שחרור שלפוחית presynaptic בתרבויות נוירונים בהיפוקמפוס.
Abstract
היכולת למדוד את הקינטיקה של שחרור שלפוחית יכול לעזור לספק תובנה כמה יסודות עצבית. כאן השתמשנו בזמן אמת הדמיה של שלפוחית שכותרתו עם FM לצבוע כדי לפקח על קצב שחרור שלפוחית presynaptic. FM4-64 הוא צבע אדום ניאון styryl amphiphilic כי מטביע לתוך הממברנות של שלפוחית סינפטית כמו אנדוציטוזה מגורה. אינטראקציות lipophilic לגרום לצבוע כדי להגדיל באופן משמעותי בשנת הקרינה, ולכן פולטות אות בהיר כאשר הקשורות שלפוחית ואחד הנומינלי כאשר בנוזל תאיים. אחרי צעד לשטוף משמש כדי לסייע להסיר צבע חיצוני בתוך קרום התא, FM הנותרים מרוכזת בתוך שלפוחית והוא גורש מכן, כאשר exocytosis הוא המושרה על ידי סיבוב נוסף של גירוי חשמלי. קצב שחרור שלפוחיות נמדדת מירידה וכתוצאה מכך הקרינה. מאז FM צבע ניתן ליישם חיצוניים transiently, הוא כלי שימושי לקביעת שיעורי exocytosis בתרבויות העצבית, במיוחד כאשר משווים את שיעורי בין הסינפסות transfected ו boutons לשלוט השכנות.
Protocol
תאים: חולדה (או עכבר) העיקרי בתרבויות נוירונים בהיפוקמפוס (14-28 ימים במבחנה).
גירוי: חשמל, מועבר דרך שתי אלקטרודות פלטינה: 70-90 mV
מיקרוסקופית: 60x עדשה שמן על מיקרוסקופ פלואורסצנטי CCD הפוכה.
תוכנה: Slidebook (Intelligent הדמיה חידושים, סנטה מוניקה, CA)
ראה עמוד משלים שיטות לפרטים נוספים
- חם HEPES שנאגרו מלוחים (בהרוורד) לטמפרטורת החדר. מוסיפים את היריבים קולטן הגלוטמט APV (50 מיקרומטר ריכוז סופי) ו CNQX (10 מיקרומטר הסופי). כל ניסוי FM בדרך כלל דורש 20-30 מ"ל בהרוורד. עבור עובד ריכוז של 10 מיקרומטר FM 4-64 (בדיקות מולקולריות), לדלל פתרון מניות 1:1000 ב בהרוורד (עם היריבים הוספה). בצע 2 מ"ל FM soln עבור כל ניסוי. מכסים ברדיד פתרון כדי למנוע חשיפה לאור.
- הר coverslip המכיל את הנוירונים על החדר אלקטרודה. בדוק כי התקשורת בתא היא רמת עם גבי קאמרית מכסה לחלוטין את האלקטרודות. הסר את כל פתרון העולה מתחתית coverslip. הוספת שמן על העדשה (אם באמצעות עדשה שמן).
- הגדרת מנגנון זלוף. לשטוף מ"ל כמה מאלה כל סדר נתון (שלא כל זרימה one ביסודיות לפני הוספת הבא): מים, מים, אתנול, אז בהרוורד. לאחר מכן להוסיף את בהרוורד (לשמור כמה מ"ל להוסיף ביד בצעדים בעתיד) ולסגור את זלוף. הגדרת מוצא זלוף ואת יניקה משני צדי המתרס בשולי coverslip. זה הכי טוב אם את שקע זלוף מגיע אל החדר, שם כמו יניקה צריך לנוח בחלקו העליון. בעוד הוספת בהרוורד (או על ידי זלוף או ביד), לפתוח את היניקה ולהתאים את עמדתה, כך טוען בתקשורת על זכות ברמה פשוט מלא מכסה את האלקטרודות.
- חפש באזור על coverslip שברצונך התמונה ולנסות להביא אותו בערך בפוקוס. אזורים אופטימלית מכילים סינפסות רבות, אבל לא צריך להיות כל כך צפוף כזה תהליכים בודדים ניתן יהיה להבחין בינן. לא צריך להיות שום ל-מינימלית גופי התא, קרום חיצוני (כגון גושים של האסטרוציטים), או חומרים לא ספציפיים אחרים (כגון מוך). לצבוע FM עשוי nonspecifically לדבוק אלה.
- השתמש "WG" קוביה המסנן (אשר מלהיב עם אור ירוק אדום ואוסף ל-הרבה פליטות אדום). הגדר Slideview "העדפות ללכוד" כדי לספק 900 AP ב 10Hz על תחילתה של תמונה 0 (בדרך כלל 300-900-APS משמשים גירוי זה טעינה). בחלון התמונה, בחר את "fluo מול אדום" הגדרות המסנן ולשנות זמן חשיפה 100 ms. בטל קיימים הגדרות timelapse. אל תיקח את כל התמונות עד שתהיה מוכן להתחיל את הגירוי.
- ודא יניקה הוא על / פתוח. מהר להוסיף את soln FM (2 מ"ל) לחדר בקצה השני של יניקה. מיד העיתונות בסדר בחלון התמונה לקחת תמונה להתחיל גירוי. חכו 30-45 שניות לאחר גירוי ואז לשטוף במהירות FM ידי הוספת ~ 2 מ"ל של בהרוורד (אני עושה זאת ביד עם טפטפת, אבל זה יכול להיעשות גם על ידי זלוף).
- שטפו את FM עם בהרוורד דרך זלוף עבור ~ 10 דקות. קצב הזרימה צריך להיות 1-1.5 mL / min. במהלך שלב זה לשטוף, לשנות את העדפות גירוי כך את הופעת גירוי מתחיל @ תמונה 10 (בדרך כלל 900-1200 APS @ 10 Hz משמשים גירוי זה destaining). כ 7 דקות לתוך לשטוף, בדוק את ההעדפות (הופעת גירוי על תמונה 10). עכשיו באמצעות חלון קטן להתמקד לבחור ולהתמקד subregion. ודא את הגדרות גירוי שונו לפני שתמשיך לשלב הבא. קחו תמונה אחת כדי לראות אם לשטוף תושלם (סינפסות הפרט צריך להיות punctated בבירור). אם לא, להגביר את קצב זרימת 0.5mL/min נוספים, לחכות עוד 2 דקות.
- לאחר לשטוף תושלם, להתאים את זמן החשיפה הדרוש כדי עדיין לקבל אות טוב, ברור (בדרך כלל בין 5-10 מילישניות. חשיפה פעמים צריך להיות ממוזער בשל photobleaching מהירה של FM). ואז להגדיר את ההעדפות timelapse לקחת 38 תמונות כל 5 שניות. בדוק את זלוף לעשות יש מספיק בהרוורד עוד 5 דקות, ולהשאיר זלוף זורם. התחל timelapse להתחיל destaining.
- לאחר destain, לשנות את ההגדרות כדי לספק גירוי 1200 AP @ 10Hz (בדרך כלל 1200-2000-APS משמשים בשלב זה סופי) על התמונה 0. כבה את הגדרות timelapse ולקחת תמונה אחת כדי להתחיל גירוי. זלוף עדיין צריך להיות זורם צעד זה יסייע להסיר כל צבע שלפוחי הנותרים FM, על מנת לקבוע הבסיס / "הכל releasable" פלואורסצנטי. לאחר הגירוי הוא סיים, לכבות את הגדרות גירוי, להביא את האזור להתמקד. סגור את זלוף ו יניקהולאחר מכן לקחת שתי תמונות הבסיס הסופי. או תמונות בודדות או Z-מחסנית תמונות (0.5 צעדים מיקרומטר) ניתן לקחת. Z-ערימות מועילים במקרה לא היה שינוי המטוס של המוקד במהלך הניסוי.
- הניסוי FM שלך נעשה. אם מיד עושים ניסויים יותר, העדשה קאמרית יש לנקות בין כל ניסוי, אך המנגנון זלוף לא צריך לנקות עד לאחר הניסוי הסופי. שוטפים את מנגנון לחלוטין עם מים, אז אתנול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כפי 300 הפוטנציאלים לפעולה (APS) מספיקה כדי לגרום לפחות סיבוב אחד של מיחזור שלפוחית, גירוי הטעינה של 300 APS או יותר ניתנת לעיתים קרובות התווית בריכה מיחזור של שלפוחית. למרות גירויים טעינת אינטנסיבי יותר, כגון APS 900, עשוי לאפשר מספר נקוב של שלפוחית נוספת כדי להיות מתויג, זה גם מעלה את כמות הזמן לצבוע יכולים להטביע ממברנות תאי, המוביל מכתים הלא ספציפית יותר. מצאתי את הצעד לשטוף להיות קריטית כדי להבטיח destaining הנכון. חשוב perfuse עם קצב זרימה 1-1.5 מ"ל לדקה, בדרך כלל 10 + 2 דקות. תמונה אחת שניתן לנקוט ~ 7 דקות לתוך לשטוף את לנטר את מידת הסרת צבע. אם יש צורך, קצב זרימת הזמן או לשטוף ניתן להגדיל מעט. על הניסויים שלנו זה היה בלתי רצויות עבור לשטוף את להמשיך יותר מ 10-12 דקות כמו זה מגדיל את הסבירות של אובדן שלפוחית תיוג דרך אירועים exocytosis ספונטנית אשר עלולה להתרחש גם כאשר התא נמצא במנוחה. עבור השלב destaining, 900-1200 APS ניתנו לשחרר את כל שלפוחית שכותרתו. בנוסף APS אחר 1200-2000 ניתנו לעתים קרובות כדי להשיג ערך הבסיסית של "הקרינה releasable", המשמש לנרמל את הנתונים destaining.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| FM 4-64 | Molecular Probes, Life Technologies | T-3166 | |
| CNQX disodium salt | Sigma-Aldrich | C-239 |
References
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
