Summary
Wir beschreiben die feinen Sezierung des stomatogastrischen Nervensystem aus dem Magen des amerikanischen Hummer (
Abstract
Mit dem Ziel, das Verständnis, wie das Nervensystem Aktivität zu erzeugen und auf die Umwelt, wiederum Neurowissenschaftler zu modellieren, die die Aktivität von Interesse zeigen und zugänglich sind und zugänglich zu experimentellen Methoden. Die stomatogastrischen Nervensystems (Tln) der amerikanischen Hummer (
Protocol
Vor Beginn dieses Protokoll den Magen des Hummers muss vom Tier entfernt werden und wie in der Begleiter JoVE Artikel (Bierman & Tobin, 2009) beschrieben. Die Mehrheit der unten beschriebenen Schritte sind unter einem Dissektionsmikroskop durchgeführt werden.
Teil I-Isolierung der kommissuralen Ganglia
- Richten Sie die Schüssel, so dass das vordere Ende (von der Lippe) weg von Ihnen und dem hinteren Ende (durch den Pylorus) zu Ihnen.
- Stellen Sie sicher, dass der Magen merken ist, dass er so flach wie möglich liegt auf dem Teller.
- Pin durch die Speiseröhre auf jeder Seite der Lippe.
- Falls erforderlich, ordnen die anderen Stifte während die Brutto-Dissektion platziert.
- Entfernen Sie die Unterhaut.
- Besorgen Sie sich die Unterhaut in der Nähe des gm2/gm3 Muskeln, lösen sie aus dieser Muskeln und sanft in die Richtung nach vorne zu ziehen.
- Separate der Unterhaut von der darunter liegenden Fett durch Schnippeln keine Verbindungen. Verwenden Sie erhöhte Sorgfalt um die zentrale Arterie, die ein wichtiger Bestandteil der stomatogastrischen Nervensystem umgibt. Verlassen Sie die Unterhaut intakt innerhalb von etwa einer 0,5 cm Radius des stomatogastrischen Ganglion, das zwischen den GM1b Muskeln sitzt.
- Cut off getrennt Unterhaut.
- Trennen Sie das Gehirn aus dem darunter liegenden Gewebe.
- Identifizieren Sie die zwei großen kommissuralen Nerven, die bilateral-Projekt aus dem vorderen Teil des Gehirns, die kommissuralen Ganglien in den vorderen Teil des Magens.
- Sieht man von diesen Nerven intakt, heben das Gehirn mit einer Pinzette und geschnitten, um das Gehirn vom Rest des Gewebes zu trennen. Achten Sie darauf, wie Sie dies tun, wie die stomatogastrischen Nerv unterhalb des Gehirns ist und muss beibehalten werden.
- Trennen Sie die kommissuralen Ganglien aus den umliegenden Gewebe.
- Folgen Sie einem der kommissuralen Nerven zu einem der kommissuralen Ganglien.
- Identifizieren Sie die Ionen und Sohn - diese Nerven müssen intakt bleiben. Die kommissuralen Ganglion haben viele Nerven ausstrahlen. Cut die meisten von ihnen (mit Ausnahme der Ionen und Sohn), aber lassen Sie einen zusätzlichen Nerven an der kommissuralen Ganglion in Position zu halten, während Sie die Dissektion zu beenden.
- Wiederholen Sie mit den anderen kommissuralen Ganglion.
- Reinigen Sie die Ionen und Sohn von lateral nach medial. Verlassen Sie die labiale Nerv intakt auf das Nervensystem, den Magen zu verankern. Die Schlundganglion sitzt wurden die Ionen s schneiden. Sie können unter ihm durch Greifen der unteren Herzkammer Nerven und zog bis unter frei geschnitten.
Teil II-Isolierung der stomatogastrischen Ganglion (STG) und die verbleibenden Nerven.
- Trennen Sie die STG aus den umliegenden Gewebe.
- Die STG sitzt in einer Arterie, die zwischen den GM1b Muskeln und bis in die gm2a, b Muskeln führt. Achten Sie auf das abgeschnittene Ende der Arterie in der Nähe des gm2a, b Muskeln.
- Ziehen Sie das abgeschnittene Ende der Arterie und nach vorne, um die dvn aussetzen. Weiter nach oben ziehen, bis Sie das Niveau der übrigen Hypodermis zu erreichen. Einmal getrennt, kann die Arterie auf die Ebene, wo es auf die restlichen Unterhaut getrimmt werden.
- Schneiden Sie die Muskellappen, dass in der Tribüne des Hummers befand.
- Heben Sie die Unterhaut oberhalb der Arterie, die Beobachtung, dass die Arterie einen Tunnel in das Fett über dem STG macht. Legen Sie ein Blatt von der Schere im Inneren der Arterie und schneiden den Muskel darüber. Überprüfen Sie, dass Sie die dvn sehen, wie Sie sicher sein, Sie werden sicher über dem STG geschnitten. Weiter Schnitt nach vorne, nach der Arterie. Wie Sie oben im STG geschnitten, werden Sie sehen können, die stn ausgehen anterior von der STG und Abtauchen in den Muskel. Weiter Schneiden nach vorne eine vollständige Trennung des Muskels oberhalb des STG.
- Löschen Sie alle Gewebe entfernt von der stn.
- Trennen Sie die agn s aus dem umgebenden Gewebe. (Auch wenn Sie nicht vorhaben, von der agn aufnehmen, werden Sie ein Teil des intakten Nerven müssen festzunageln das Ganglion für die intrazelluläre Aufnahme.)
- Um besser zu sehen, die agn s, entfernen Sie die restlichen Unterhaut und eine dünne Schicht der darunter liegenden Muskeln.
- Unmittelbar hinter der STG, identifizieren einen dunklen Tunnel in der Fett-und Muskelgewebe auf beiden Seiten des dvn.
- Stick eine Schere Klinge im Inneren des Tunnels und schneiden das Gewebe über dem Nerv. Weiter Schnitt seitlich, im Anschluss an die Nerven, um es zu isolieren. (Ein paar Millimeter ist ausreichend für Pinning das Ganglion, sondern entlarven mindestens 5 mm von der agn, wenn Sie von ihm aufnehmen möchten.)
- Lösen Sie die agn aus dem Muskel es innerviert, indem die Verbindungen.
- Wiederholen Sie auf der anderen Seite auf die andere agn isolieren.
- Sobald beide agn s haben seziert worden, schneiden alle Muskeln und Gewebe verbindet die STG in den Magen.
- Isolieren Sie die mvn s. Sie sind ein bilaterales Paar kleiner Nerven abzweigen der LVN und Verfahrgeschwindigkeit seitlich unterhalb des Fettes.
- Entweder mit einer Schere oder zwei Zangen durch das Fett auf der einen Seite des dvn geschnitten, in der Nähe, wo es Filialen in den beiden lvn s. Hier sind Sie weit entfernt von der mvn s und wird es nicht riskieren, schneidet sie.
- Heben Sie die Fettschicht, und identifizieren Sie die kleinen mvn darunter. Diese Nerven laufen medial nach lateral direkt hinter dem Niveau des GM1b Muskeln.
- Entfernen Sie die Fettschicht über den mvn, so dass der Nerv intakt jetzt so wird es nicht verheddert. Sie werden ihre seitlichen Ende aus dem Off den Magen Schnitt am Ende der Präparation.
- Wiederholen Sie den Vorgang auf der anderen Seite auf die andere mvn isolieren.
- Isolieren Sie die lvn s und hinteren Nerven.
- Ab wo die lvn s Filiale seitlich vom dvn, folgen einem lvn indem das Fett darüber. Abhängig von der Vorbereitung, manchmal die ganze Fettschicht über dem Nerv kann abgezogen werden.
- Weiter enthüllt die lvn bis zu dem Punkt, wo die psn abzweigt.
- Isolieren Sie die PYN.
- Suchen Sie die PYN, es ist ein Nerv reist nach hinten über den Pylorus.
- Entfernen Sie die dünne Membran, die dieser Region.
- Isolieren Sie die PYN, indem ein kleiner Teil des Pylorus, an der PYN.
- Heben Sie den Pylorus Abschnitt und schneiden das Gewebe auf beiden Seiten des PYN, bis Sie den Zweig, der pdn legt zu erreichen.
- Isolieren Sie die PDN.
- Suchen Sie die pdn, es ist ein Nerv reist nach hinten, um den Pylorus Dilatator Muskel.
- Schneiden Sie einen kleinen Ausschnitt des Pylorus Dilatator Muskel, an der pdn.
- Heben Sie den Pylorus Dilatator Muskel Abschnitt weggeschnitten das Gewebe auf beiden Seiten des pdn, bis Sie den Zweig, der PYN legt zu erreichen.
- Isolieren Sie die ventralen lvn, dass die PYN und pdn verbindet sich mit dem LVN.
- Auf der dreieckigen Filiale Punkt, wo die PYN und pdn der ventralen lvn verbinden, isolieren, jeder kleine Abschnitt der Nerv, zweigt der ventralen lvn, wie die vpln. Dies wird als Griff verwendet werden, um auf der Bauchseite lvn ziehen.
- Heben Sie den Griff und schneiden das Gewebe auf beiden Seiten des ventralen lvn, arbeiten in der Richtung nach vorne, bis Sie den Punkt erreichen, wo die psn abzweigt.
- Wiederholen Sie die Schritte 10 bis 13 des LVN und hinteren Nerven auf der anderen Seite zu isolieren.
- Lösen Sie die stomatogastrischen Nervensystem aus dem Magen.
- Um vollständig zu lösen die lvn aus dem Bauch, auf dem PSN zu ziehen und schneiden Sie alle Gewebe und Nerven an der LVN und ventralen LVN, mit Ausnahme der pdn und PYN. Wiederholen Sie diesen Vorgang auf der anderen Seite.
- Schneiden Sie die seitlichen Ende jeder mvn. Heben Sie die seitlichen Ende und schneiden alle überflüssigen Anlagen zwischen den Nerv und die zugrunde liegenden Magengewebe.
- Am vorderen Ende, schneiden alle überflüssigen Anlagen der kommissuralen Ganglien, und schneiden Sie die labiale Nerven auf jeder Seite.
- Optisch scannen stomatogastrischen Nervensystem System zur Identifizierung und dann schneiden Sie keine zusätzlichen Anhänge in den Magen Gewebe.
- Schnappen Sie auf das vordere Ende der beiden kommissuralen Nerven, über dem kommissuralen Ganglien, und ziehen Sie die stomatogastrischen Nervensystem aus dem Magen und verschieben Sie es auf der Seite der Schale. Wie Sie dies tun, schneiden alle verbleibenden Anlagen für das Nervensystem frei.
- Bereiten Sie die kleinen Sylgard Gericht.
- Rub einige Magengewebe gründlich auf die Oberfläche des Sylgard in die kleine Schale. Dadurch verringert sich die Hydrophobie der Sylgard, so dass Kochsalzlösung wird gleichmäßig verteilt über das Gericht.
- Spülen und füllen Sie die Sylgard Gericht mit gekühlter Kochsalzlösung.
- Übertragen des Nervensystems auf die vorbereitete Sylgard Gericht durch Ergreifen des vorderen Enden der beiden kommissuralen Nerven, die Aufhebung des Nervensystems aus der großen Schüssel und legte es in die kleine Schale.
- Pin der Tln in die kleine Schale mit einer Kombination aus minuten Stifte und dünner Stifte aus Wolframdraht geschnitten.
- Stellen Sie sicher, dass die Vorbereitung Dorsalseite wird durch die Überprüfung, dass die minderwertigen ventrikuläre Nerv ist weg von der Sylgard zeigt.
- Entfernen Sie das Gehirn und die Pin kommissuralen Nerven.
- Ziehen Sie das Nervensystem eng und flach, indem jeder der psn s hinten und seitlich und Pinning sie nieder.
- Entfernen Sie den Pylorus Dilatator Muskel von der pdn s, und Pin die pdn s.
- Entfernen Sie diePylorus Segment aus dem PYN s, und Pin die PYN s.
- Pin, um alle verbleibenden isolierten Nerven wie die labiale Nerven, die mvn s und agn s.
- Desheath der STG.
- Sicherstellen, dass die STG ist gegen die Sylgard flach und straff gehalten durch den seitlichen agn s, der vorderen und der hinteren stn dvn.
- Ordnen Sie die Beleuchtung, um die Visualisierung der Axone im dvn ermöglichen.
- Mit einem kleinen Stift oder feinen Wolfram-Nadel, machen Sie einen kleinen flachen Loch in der Scheide um die dvn, unmittelbar hinter der STG.
- Ziehen Sie die Nadel in der dvn, dorsal der Axone, um einen horizontalen Riss in der Nervenscheide zu schaffen.
- Besorgen Sie sich die Klappe des Nervenscheide hinter der STG und ziehen nach vorne, um den Mantel von der Rückenseite des STG zu entfernen.
| Abkürzungen: | |
| Tln | Stomatogastrischen Nervensystems |
| STG | Stomatogastrischen Ganglion |
| CoG | Kommissuralen Ganglion |
| stn | stomatogastrischen Nerven |
| mvn | medial ventrikuläre Nerven |
| Ion | inferior ösophagealen Nerven |
| Sohn | überlegen ösophagealen Nerven |
| agn | Magenvorderwand Nerven |
| dvn | dorsalen ventrikulären Nerven |
| lvn | lateralen Ventrikel Nerven |
| psn | hinteren Magen Nerven |
| vpln | ventralen hinteren seitlichen Nerven |
| PYN | Pylorus Nerven |
| pdn | Pylorus Dilatator Nerven |
Discussion
Die Anatomie der Hummer Magen und Tln wurde auch zuvor 5,6, beschrieben und Variationen dieser Sektion Verfahren wurden in zahlreichen Studien eingesetzt worden. Wir empfehlen vertraut zu machen mit der Anatomie des Magen 5-7 und Tln 5,8 vor Beginn der Dissektion. Solche Vertrautheit verringert die Gefahr des zufälligen Schäden an Nerven und Gewebe.
Zur Erhaltung der Gesundheit der Vorbereitung ist es wichtig, auf die Vorbereitung an einem kühlen Temperatur zu halten. Dies geschieht durch einfachen Austausch der Kochsalzlösung alle 30 Minuten mit 4 ˚ C Kochsalzlösung in einem Kühlschrank aufbewahrt erreicht. Wenn in kalter Kochsalzlösung eingetaucht ist das isolierte Tln Vorbereitung lebensfähig für viele Stunden. Recordings in Zusammenhang Homarus gammarus über stabile rhythmische Aktivität von der STG nachgewiesen ganzen 5 Tage in vitro 9; ähnlich Robustheit hat in H. gesehen worden americanus (pers. Beob.).
Modulatorischer Eingang des STG vom kommissuralen Ganglien ist erforderlich, um den laufenden Motor Muster zu erhalten. Daher die Aufrechterhaltung eines normalen rhythmische Aktivität dieser Ganglien und das Ion, Sohn und stn Nerven müssen intakt gehalten werden. Die Dissektion beschreiben wir bewahrt mehreren motorischen Nerven (mit Motoneuronen Axone): Die agn s (mit Magen-Mill (GM) Axone), die mvn s (mit Lateral Gastric (LG) und Inferior Cardiac (IC) Axone), die PYN s (mit Pylorusstenose Neuron (PY) Axone), die pdn s (mit Pylorusstenose Dilatator (PD) Axone) und der lvn s (mit Lateral Pylorusstenose (LP), mediale Gastric (MG), LPG Axone als auch solche von GM, PD und PY). Durch Sezieren zusätzliche (oder anders) Nerven, können andere Motoneuronen Axone aufgezeichnet werden. Jede einzelne Art der motorischen Neurons Axon können einzeln durch Sezieren und die Aufnahme von Nerven innervieren die Muskeln, auf die aufgezeichnet werden, die Art der Neuron-Projekte.
Diese Vorbereitung kann für eine Vielzahl von Studien über die Funktion des Nervensystems fokussiert eingesetzt werden. Die Aktivität der Neuronen aufgezeichnet entweder mittels intrazellulärer, scharfe Elektrode Aufnahmen von Somata oder Axonen, oder durch die Aufnahme elektrischer Impulse extrazellulär von den Nerven sein. Viele Ionenkanäle in der STG Neuronen wurden teilweise kloniert und mRNA kann von Hand abgezogen Somata 10,11 gemessen werden.
Acknowledgments
Wir möchten unsere Berater, Dr. Eva Marder erkennen. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health gewährt NS17813 zu Eva Marder und NS059255 zu AE T. unterstützt
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter) | Tool | California Fine Wire Company | Cut into 1-2mm pieces to use as fine pins. | |
| Forceps #5 | Tool | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Minuten Pins | Tool | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Moria Spring Scissors (7mm blades) | Tool | Fine Science Tools | 15370-52 | These are the top of the line. There are more economical spring scissors available from the same company. |
| Petri Dish (100x15mm) | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | Fill 2-4mm with Sylgard 182. |
| Sylgard 182 | Other | Dow Corning | 182 | |
| Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26018-17 | Optional. Desheathing can be done with scissors and fine forceps alone. |
| Super fine forceps #5SF | Tool | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Tungsten Needles | Tool | Fine Science Tools | 10130-05 | Optional. Desheathing can be done with scissors or with pins cut from fine tungsten wire. |
| Dissection microscope |
References
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- Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. A small-systems approach to motor pattern generation. Nature. 417, 343-350 (2002).
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