Summary
אנו מתארים את לנתיחה קנס של מערכת העצבים stomatogastric מהבטן של לובסטר האמריקאית (
Abstract
במטרה להבין כיצד מערכת העצבים לייצר פעילות להגיב לסביבה, מדעני מוח לפנות מערכות מודל התערוכה את הפעילות של ריבית נגישים מקובל שיטות ניסיוניות. מערכת העצבים stomatogastric (STNS) של לובסטר האמריקאית (
Protocol
לפני תחילת בפרוטוקול זה הקיבה של לובסטר יש להסיר מן החיה והכינו כמתואר במאמר נלווה יופיטר (בירמן & Tobin, 2009). רוב הצעדים המפורטים להלן הם להתבצע תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
חלק I-בידוד הגרעינים Commissural
- אוריינט המנה כך בסוף קדמית (על ידי השפה) היא ממך, ואת הקצה האחורי (על ידי השוער) היא כלפיך.
- ודא כי הקיבה בסיכות, כך שהוא שוכב ככל האפשר על המנה.
- פין במורד הוושט בכל צד של השפה.
- במידת הצורך, לארגן מחדש את סיכות אחרים להציב במהלך דיסקציה ברוטו.
- הסר את ובהיפודרמיס.
- תפוס את ובהיפודרמיס ליד gm2/gm3 השרירים, לנתק אותו מן השרירים הללו ומשוך בעדינות לכיוון הקדמי.
- הפרד את ובהיפודרמיס משומן הבסיס על ידי החיתוך כל החיבורים. שימוש מוגבר טיפול סביב עורק מרכזי, אשר סוגר חלק מרכזי של מערכת העצבים stomatogastric. השאירו את ובהיפודרמיס שלמים בתוך רדיוס על 0.5 ס"מ של הגנגליון stomatogastric, אשר יושבת בין השרירים gm1b.
- שנותקו ובהיפודרמיס מופרדים.
- ניתוק המוח מן הרקמה הבסיסית.
- זיהוי שני עצבים commissural גדול כי הפרויקט בילטרלי מהחלק הקדמי של המוח כדי בגרעיני commissural בחלק הקדמי של הקיבה.
- השארת העצבים האלה ללא פגע, בעדינות להרים את המוח עם מלקחיים לחתוך כדי להפריד בין המוח משאר הרקמות. היזהר כאשר אתה עושה את זה, כמו עצב stomatogastric הוא מתחת המוח חייב להישמר ללא פגע.
- הפרד את הגרעינים commissural מן הרקמה שמסביב.
- בצע אחד העצבים commissural לאחד הגרעינים commissural.
- זהה את יון ובן - עצבים אלה חייב להישאר שלם. הגנגליון commissural יהיה הרבה עצבים מקרין החוצה. גזור רובם (למעט יון ובנו), אך להשאיר עצב אחד נוסף המצורף כדי להחזיק את הגנגליון commissural במקום בעת לסיים את לנתיחה.
- חזור עם הגנגליון commissural אחרים.
- נקו את יון ואת בנו מן לרוחב המדיאלי. עזוב את העצב שפתני שלם לעגן את מערכת העצבים בבטן. הגנגליון הוושט יושב היו של יון מצטלבים. ניתן לנקות מתחתיו על ידי לתפוס את העצב חדרית נחות ומושך עד לחתוך מתחת.
חלק II-בידוד גנגליון Stomatogastric (STG) והעצבים הנותרים.
- הפרד את STG מן הרקמה שמסביב.
- STG יושב בתוך עורק המפעילה בין השרירים gm1b ולמטה, שרירי gm2a ב. חפשו בסוף לחתוך של העורק ליד, השרירים gm2a ב.
- משוך את הקצוות של העורק מעלה anteriorly, כדי לחשוף את dvn. המשך למשוך עד שתגיע לרמה של ובהיפודרמיס הנותר. לאחר מופרדים, העורק יכול להיות trimmed לרמה שבה הוא נוגע ובהיפודרמיס הנותרים.
- חותכים את יריעת שריר כי היה ממוקם הדוכן של לובסטר.
- להרים את ובהיפודרמיס מעל העורק, וציין כי העורק גורמת מנהרה בתוך השומן מעל STG. שים אחד להב המספריים בתוך העורק וחותכים את השריר מעליו. בדוק כי אתה יכול לראות את dvn כפי שאתה לחתוך כדי להיות בטוח שאתה בבטחה מעל STG. המשך קיצוץ anteriorly, בעקבות העורק. כפי שאתה לחתוך מעל STG, תוכל לראות STN הבוקע מן anteriorly STG ולמטה צלילה לתוך השריר. המשך קיצוץ anteriorly באופן מלא להפריד את השריר מעל STG.
- נקה כל רקמה הרחק STN.
- הפרד את AGN s מן הרקמה הסובבת. (גם אם אתה לא מתכנן להקליט AGN, תצטרך חלק העצב שלם להצמיד את הגנגליון להקלטות תאיים).
- כדי לראות טוב יותר את s AGN, להסיר את ובהיפודרמיס הנותרים שכבה דקה של השריר הבסיסית.
- האחורי רק כדי STG, לזהות מנהרה אפלה שומן ושריר משני צדי dvn.
- סטיק להב אחד מספריים בתוך המנהרה ולחתוך את הרקמות מעל העצב. המשך קיצוץ רוחבי, בעקבות עצב, לבודד אותה. (כמה מילימטרים מספיק עבור מצמיד גנגליון, אבל לחשוף לפחות 5 מ"מ של AGN, אם אתה מתכנן להקליט ממנו.)
- לנתק את AGN מן השריר זה innervates על ידי חיתוך קשרים.
- חזרי על הפעולה בצד השני כדי לבודד את AGN אחרים.
- לאחר שני AGN s כבר גזור, לחתוך את כל השרירים ורקמות חיבור STG בבטן.
- לבודד את s. mvn הם זוג דו צדדי של העצבים הקטנים מתפצלים lvn ו חוצים רוחבית מתחת השומן.
- או להשתמש במספריים או שניים מלקחיים לחתוך שומן בצד אחד של dvn, ליד איפה זה הסניפים לשתי lvn s. כאן אתם רחוקים זה mvn ולא יסתכן חיתוך אותם.
- להרים את שכבת השומן, ולזהות את מתחת mvn קטן. עצבים אלה לרוץ המדיאלי האחורי רק כדי רוחבית לרמה של שרירי gm1b.
- הסירו את שכבת השומן מעל mvn, משאיר עצב שלם עכשיו אז זה לא יהיה סבוך. תוכלו לחתוך סוף לרוחב שלה מעל הבטן בסוף הניתוח.
- חזור על התהליך בצד השני כדי לבודד את mvn אחרים.
- לבודד את lvn s והעצבים האחורי.
- החל שם סניף של lvn רוחבית את dvn, בצע lvn על ידי חיתוך שומן מעליו. בהתאם הכנה, לפעמים שכבת השומן מעל כל העצב יכול להיות הוריד.
- המשך לחשוף את lvn עד לנקודה שבה הענפים PSN משם.
- לבודד את pyn.
- אתר את pyn, זהו עצב נסיעה בדיעבד מעל השוער.
- הסר את קרום דק המכסה את האזור הזה.
- לבודד את pyn ידי חיתוך קטע קטן של השוער, המצורפת pyn.
- הרם בעדינות את החלק השוער וחתך את הרקמה משני צדי pyn עד שתגיע ענף שמתחבר PDN.
- לבודד את PDN.
- אתר את PDN, הוא נוסע בדיעבד עצב לשריר המרחיב השוער.
- גזור קטע קטן של השריר המרחיב השוער, המצורפת PDN.
- הרם בעדינות את החלק השוער השריר המרחיב, לחתוך את הרקמה משני צדי PDN עד שתגיע ענף שמתחבר pyn.
- לבודד את lvn הגחון, שמחבר את pyn ו PDN כדי lvn.
- בשלב הסניף משולש שבו pyn ו PDN להתחבר lvn הגחון, לבודד כל קטע קטן של העצב מתפצל lvn הגחון, כגון vpln. זה ישמש ידית למשוך lvn על הגחון.
- הרם את ידית וחתך את הרקמה משני צדי lvn הגחון, עובד בכיוון הקדמי עד שתגיע לנקודה שבה הענפים PSN משם.
- חזור על שלבים 10-13 כדי לבודד את העצבים ואת lvn האחורי בצד השני.
- ניתוק מערכת העצבים stomatogastric מהבטן.
- כדי לנתק את מלא lvn מהבטן, משוך על PSN וחותכים כל הרקמות והעצבים המחוברים lvn ו lvn הגחון, למעט PDN ו pyn. חזור על תהליך זה בצד השני.
- חותכים את קצה לרוחב של mvn כל אחד. הרם את קצה לרוחב וחותכים כל הקבצים המצורפים זרים בין העצב ואת רקמת הקיבה הבסיסית.
- בסוף הקדמי, לחתוך קבצים מצורפים זרים כדי בגרעיני commissural, וחתך את העצב שפתני בכל צד.
- ראייה לסרוק את המערכת stomatogastric מערכת העצבים לזהות ולאחר מכן לחתוך קבצים מצורפים נוספים ברקמת הקיבה.
- גזל אל הקצה הקדמי של שני העצבים commissural, מעל בגרעיני commissural, וקליפת מערכת העצבים stomatogastric את הקיבה להעביר אותו לצד המנה. כאשר אתם עושים זאת, לחתוך קבצים מצורפים הנותרים כדי לשחרר את מערכת העצבים.
- מכינים את המנה Sylgard קטן.
- רוב כמה רקמת הקיבה ביסודיות על פני השטח של Sylgard בצלחת קטנה. זה יקטין את hydrophobicity של Sylgard, כך מלוחים תפיץ באופן שווה על פני הצלחת.
- לשטוף ולמלא את המנה Sylgard עם מלוחים צונן.
- מעבירים את מערכת העצבים כדי בצלחת Sylgard שהוכן על ידי גרירה מסתיים הקדמי של שני העצבים commissural, מרימים את מערכת העצבים מתוך צלחת גדולה, מניחים אותו בצלחת קטנה.
- פין STNS בצלחת קטנה באמצעות שילוב של סיכות minuten וסיכות לחתוך דק מחוט טונגסטן.
- ודא כי ההכנה היא בצד הגבי על ידי בודק את העצב חדרית נחות מצביע הרחק Sylgard.
- הסר את המוח ואת הסיכה עצבים commissural.
- משוך בעדינות את מערכת העצבים חזק ושטוח על ידי משיכת כל אחד של PSN בדיעבד ו רוחבית, הצמיד אותם.
- הסר את השריר המרחיב השוער מן s PDN, ואת הסיכה s. PDN
- הסר אתקטע מן השוער של pyn, ואת הסיכה s. pyn
- להצמיד כל העצבים שנותרו מבודדים כגון העצבים שפתי, את mvn s ו AGN s.
- Desheath STG.
- ודא STG הוא שטוח נגד Sylgard והחזיק מתוח לרוחב ידי AGN ים, STN הקדמי ואת dvn האחורי.
- מסדרים את התאורה כדי לאפשר ויזואליזציה של אקסונים בתוך dvn.
- בעזרת סיכה קטנה, או מחט טונגסטן בסדר, לעשות חור רדוד קטן נדן סביב dvn, האחורי רק כדי STG.
- משוך את המחט על פני dvn, הגבי של אקסונים, ליצור קרע אופקי נדן העצב.
- תפוס את כנף נדן עצב האחורי אל STG ולמשוך anteriorly להסיר את נדן מהצד הגבי של STG.
| קיצורים: | |
| STNS | מערכת העצבים Stomatogastric |
| STG | Stomatogastric גנגליון |
| בורג | Commissural גנגליון |
| STN | stomatogastric עצב |
| mvn | חדרית המדיאלי עצב |
| יון | עצב הוושט נחות |
| בן | עצב הוושט מעולה |
| AGN | עצב קיבה הקדמי |
| dvn | חדרית הגב עצב |
| lvn | חדרית לרוחב עצב |
| PSN | הבטן האחורי עצב |
| vpln | עצב לרוחב הגחון האחורי |
| pyn | השוער עצב |
| PDN | המרחיב השוער עצב |
Discussion
האנטומיה של הקיבה לובסטר STNS תוארה גם בעבר 5,6, ו - וריאציות של הליך זה לנתיחה כבר נוצלו במחקרים רבים. אנו ממליצים היכרות עם האנטומיה של הקיבה 5-7 ו STNS 5,8 לפני תחילת והניתוחים. היכרות כזו תקטין את הסיכון של נזק מקרי עד עצבים ורקמות.
כדי לשמור על הבריאות של התכשיר, חשוב לשמור על הכנת בטמפרטורה קרירה. זו מושגת בקלות על ידי החלפת מלוחים מדי 30 דקות עם 4 מלוחים ˚ C כל הזמן במקרר. כאשר שקוע מלוחים קר, הכנת מבודד STNS היא בת קיימא במשך שעות רבות. הקלטות הקשורות gammarus Homarus הראו פעילות קצבית יציבה של STG במשך 5 ימים במבחנה 9; חוסן דומה כבר ראיתי ב H. americanus (pers. obs.).
הקלט Modulatory אל STG מן הגרעינים commissural נדרש לשמר את דפוסי מנוע מתמשך. לכן, כדי לשמור על פעילות קצבית נורמלית אלה הגרעינים ואת בנו, יון, והעצבים STN חייב להישמר ללא פגע. דיסקציה אנו מתארים משמר העצבים המוטורית מספר (המכיל מנוע נוירון אקסונים): s AGN (המכיל מיל קיבה (GM) אקסונים), את זה mvn (המכיל קיבה הרוחב (LG) ונחות לב (IC) אקסונים), את pyn s (המכיל השוער נוירון (PY) אקסונים), את זה PDN (המכיל מרחיב השוער (PD) אקסונים), ואת זה lvn (המכיל השוער הרוחב (LP), קיבה המדיאלי (MG), אקסונים גפ"מ כמו גם אלה של ג'נרל מוטורס, פ"ד ו PY). עד לנתח נוסף (או שונה) העצבים, האקסונים הנוירון המוטורי אחרים עשויים להיות מוקלט. כל סוג יחיד של הנוירון המוטורי האקסון עשוי להיות מוקלט בנפרד על ידי לנתח הקלטה של העצב innervating השריר אשר סוג זה של פרויקטים נוירון.
הכנה זו עשויה לשמש עבור מגוון רחב של מחקרים ממוקדים על התפקוד של מערכת העצבים. הפעילות של נוירונים עשוי להיות מוקלט או באמצעות תאיים, הקלטות אלקטרודה חד somata או אקסונים, או על ידי הקלטה דחפים חשמליים extracellularly מן העצבים. תעלות יונים רבים הנוירונים STG היו משובטים חלקית mRNA ניתן למדוד מתוך somata משך ידני 10,11.
Acknowledgments
ברצוננו להודות יועץ שלנו, ד"ר איב מרדר. מחקר זה מומן על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקים NS17813 אל וחוה מרדר ו NS059255 אל AE ט
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Tungsten Wire (0.001 in. diameter) | Tool | California Fine Wire Company | Cut into 1-2mm pieces to use as fine pins. | |
| Forceps #5 | Tool | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Minuten Pins | Tool | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Moria Spring Scissors (7mm blades) | Tool | Fine Science Tools | 15370-52 | These are the top of the line. There are more economical spring scissors available from the same company. |
| Petri Dish (100x15mm) | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | Fill 2-4mm with Sylgard 182. |
| Sylgard 182 | Other | Dow Corning | 182 | |
| Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26018-17 | Optional. Desheathing can be done with scissors and fine forceps alone. |
| Super fine forceps #5SF | Tool | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Tungsten Needles | Tool | Fine Science Tools | 10130-05 | Optional. Desheathing can be done with scissors or with pins cut from fine tungsten wire. |
| Dissection microscope |
References
- Marder, E., Bucher, D. Central pattern generators and the control of rhythmic movements. Curr. Biol. 11, R986-R996 (2001).
- Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. A small-systems approach to motor pattern generation. Nature. 417, 343-350 (2002).
- Clemens, S., Massabuau, J. C., Legeay, A., Meyrand, P., Simmers, J. In vivo modulation of interacting central pattern generators in lobster stomatogastric ganglion: influence of feeding and partial pressure of oxygen. J. Neurosci. 18, 2788-2799 (1998).
- Bierman, H. S., Tobin, A. E. Gross dissection of the stomach of the lobster, Homarus americanus. J Vis Exp. 27, (2009).
- Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268, 161-220 (1974).
- Herrick, F. H. Natural history of the American lobster. Bull. U.S. Bur. Fish. 29, 219-252 (1909).
- Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).
- Bucher, D., Taylor, A. L., Marder, E. Central pattern generating neurons simultaneously express fast and slow rhythmic activities in the stomatogastric ganglion. J. Neurophysiol. 95, 3617-3632 (2006).
- Mizrahi, A., Dickinson, P. S., Kloppenburg, P., Fénelon, V., Baro, D. J., Harris-Warrick, R. M., Meyrand, P., Simmers, J. Long-term maintenance of channel distribution in a central pattern generator neuron by neuromodulatory inputs revealed by decentralization in organ culture. J. Neurosci. 21, 7331-7339 (2001).
- Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. Variable channel expression in identified single and electrically coupled neurons in different animals. Nat. Neurosci. 9, 356-362 (2006).
- Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. E. Quantitative expression profiling of identified neurons reveals cell-specific constraints on highly variable levels of gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13187-13191 (2007).
