Summary
De mogelijkheid om de kinetiek van blaasje los maatregel kan hulp bieden inzicht in een aantal van de basisprincipes van neurotransmissie. Hier gebruikten we real-time beeldvorming van blaasjes gelabeld met de rode fluorescente kleurstof FM 4-64 om de snelheid van presynaptische blaasje release in hippocampale neuronale culturen te meten.
Abstract
De mogelijkheid om de kinetiek van blaasje los maatregel kan hulp bieden inzicht in een aantal van de basisprincipes van neurotransmissie. Hier gebruikten we real-time beeldvorming van blaasjes voorzien van FM kleurstof om de snelheid van presynaptische blaasje los te controleren. FM4-64 is een rood fluorescerende amfifiele styrylkleurstoffen kleurstof die integreert in de membranen van synaptische blaasjes als endocytose wordt gestimuleerd. Lipofiele interacties zorgen dat de kleurstof om sterk te verhogen in fluorescentie, dus uitzenden van een helder signaal wanneer geassocieerd met blaasjes en een nominale een toen in de extracellulaire vloeistof. Na een wasstap wordt gebruikt om externe kleurstof te verwijderen binnen de plasmamembraan, wordt de resterende FM geconcentreerd in de blaasjes en wordt dan verwijderd wanneer exocytose wordt veroorzaakt door een andere ronde van elektrische stimulatie. De snelheid van blaasjes release is gemeten vanaf de daaruit voortvloeiende daling van de fluorescentie. Omdat FM kleurstof kan worden toegepast externe en tijdelijk, het is een nuttig hulpmiddel voor het bepalen van de tarieven van de exocytose in neuronale culturen, vooral bij het vergelijken van de tarieven tussen getransfecteerde synapsen en naburige controlegebieden boutons.
Protocol
Cellen: Rat (of muis) primaire hippocampale neuronale culturen (14-28 dagen in vitro).
Stimulatie: Elektrische, geleverd via twee platina-elektroden; 70-90 mV
Microscopie: 60x olie lens op een omgekeerde CCD fluorescentiemicroscoop.
Software: Slidebook (Intelligent Imaging Innovations, Santa Monica, CA)
Zie aanvullende methoden pagina voor meer details
- Warm HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS) op kamertemperatuur. Voeg de glutamaat receptor antagonisten APV (50 uM eindconcentratie) en CNQX (10 uM def.) Elke FM-experiment vereist meestal 20 tot 30 ml HBS. Voor het werken concentratie van 10 uM FM 4-64 (Molecular Probes), vul voorraad oplossing 1:1000 in HBS (met antagonisten toegevoegd). Maak 2 mL FM Soln voor elk experiment. Bedek oplossing met folie om blootstelling aan licht te voorkomen.
- Monteer de dekglaasje met de neuronen op de elektrode kamer. Controleer of de media in de kamer is het niveau met de bovenkant van kamer en volledig bedekt de elektroden. Verwijder eventuele overtollige oplossing van de onderkant van dekglaasje aan. Voeg olie aan de lens (bij gebruik van een olie-lens).
- Stel de perfusie apparaat. Eerst spoelen met een paar ml van elk van de volgende in de aangegeven volgorde (grondig laten elk een stroom voor het toevoegen van de volgende): water, ethanol, water, dan HBS. Voeg vervolgens de HBS (behoudens enkele mL toe te voegen met de hand in de toekomst stappen) en sluit de perfusie. Stel de perfusie stopcontact en de zuigkracht aan weerszijden aan de randen van het dekglaasje. Het is het beste als de perfusie outlet tot in de kamer, waar als de afzuiging dient te rusten op de top. Terwijl het toevoegen van HBS (hetzij door perfusie of met de hand), open de zuig-en pas de positie, zodat het houdt de media op het juiste niveau, net volledig over de elektroden.
- Kijk voor het gebied op het dekglaasje u wilt om de afbeelding en probeer ongeveer brengen in focus. Optimale gebieden bevatten veel synapsen, maar moet niet zo dicht zodat de individuele processen te onderscheiden te worden. Er mag geen-to-minimal cellichamen, vreemde membranen (zoals pollen van astrocyten), of andere niet-specifieke materialen (zoals lint). De FM-kleurstof kan zich aan deze niet-specifiek.
- Gebruik de "werkgroep" filter kubus (die prikkelt met groen licht en verzamelt rood-to-ver rode emissies). Stel SlideView "capture voorkeuren" om 900 AP leveren bij 10 Hz bij aanvang van de afbeelding 0 (meestal 300 tot 900 access points worden gebruikt voor het laden van deze stimulus). In het beeld-venster, selecteer de "fluo-vis-rood" filter instellingen en verander de blootstelling tijd tot 100 ms. Schakel alle reeds bestaande timelapse-instellingen. Neem geen foto's totdat u klaar bent om de stimulatie te starten.
- Zorg ervoor dat de zuigkracht is op / open. Snel toe te voegen van de FM-Soln (2 ml) om de kamer aan de andere kant van de zuigkracht. Meteen goed druk in de afbeelding venster om een afbeelding te nemen en stimulatie beginnen. Wacht 30-45 seconden na stimulatie en dan snel wassen FM door het toevoegen van ~ 2 mL van HBS (Ik doe dit met de hand met een pipet, maar dit kan ook gebeuren door perfusie worden).
- Was de FM met HBS via perfusie voor ~ 10 minuten. Het debiet moet 1 tot 1,5 ml / min zijn. Tijdens deze wasstap, wijzigt u de stimulatie voorkeuren, zodat het begin van de stimulatie begint @ image 10 (meestal 900 tot 1200 AP @ 10 Hz worden gebruikt voor deze ontkleuren stimulus). Ongeveer 7 min in de was, controleer de voorkeuren (begin van de stimulus afbeelding 10). Nu het gebruik van de kleine focus venster kiezen en focus een subregio. Zorg ervoor dat de stimulatie-instellingen zijn gewijzigd voordat u verder gaat naar de volgende stap. Neem een enkel beeld om te zien of de was is compleet (individuele synapsen moet duidelijk worden punctated). Zo niet, verhoging van de stroomsnelheid een extra 0.5mL/min, en wacht nog 2 minuten.
- Was eenmaal is voltooid, stelt u de belichting tijd als nodig is om nog steeds ontvangt een goed, duidelijk signaal (meestal tussen 50-100 ms. Belichtingstijden moet gevolg van de snelle fotobleken van de FM worden geminimaliseerd). Stel vervolgens de timelapse voorkeuren te nemen 38 beelden om de 5 seconden. Controleer de perfusie te maken is er genoeg HBS nog 5 minuten en laat perfusie stromen. Start timelapse om te beginnen ontkleuren.
- Na destain, veranderen stimulatie-instellingen tot 1200 AP @ 10Hz (meestal 1200-2000 AP's zijn gebruikt voor dit laatste stap) te leveren op afbeelding 0. Schakel de timelapse instellingen en neem een enkel beeld voor stimulatie beginnen. De perfusie moet nog steeds stromen Deze stap zal helpen alle resterende vesiculaire FM kleurstof, om baseline / "totaal vrij te geven" fluorescentie te bepalen. Nadat de stimulus is voltooid, schakelt u de stimulatie-instellingen, te brengen in de regio in beeld. Sluit de perfusie en zuig, En neem dan twee laatste baseline beelden. Ofwel losse foto's of Z-stack beelden (0,5 micrometer stappen) kunnen worden genomen. Z-stacks zijn nuttig voor het geval er was een verschuiving in het vlak van de focus tijdens het experiment.
- Uw FM-experiment is gedaan. Indien onmiddellijk doen meer experimenten, moet de lens en de kamer schoongemaakt worden tussen elke proef, maar de perfusie apparaat hoeft niet te worden schoongemaakt pas na het laatste experiment. Volledig Spoel het apparaat met water, dan ethanol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Als 300 actiepotentialen (AP's) is voldoende om tenminste een ronde van blaasje recycling, een laad-stimulus van 300 AP's of meer wordt vaak gegeven aan het etiket van de recycling pool van blaasjes veroorzaken. Hoewel de meer intense laden stimuli, zoals 900 AP, kan toestaan dat een nominale aantal extra blaasjes te worden geëtiketteerd, dit verhoogt ook de hoeveelheid tijd die de kleurstof kan insluiten in extracellulaire membranen, wat leidt tot een grotere niet-specifieke kleuring. Ik heb de wasstap om kritisch om een goede ontkleuren te garanderen. Het is belangrijk om perfuseren bij debiet 1 tot 1,5 ml per minuut, meestal gedurende 10 + 2 minuten. Een enkel beeld kan worden genomen ~ 7 minuten in de was in de mate van kleurstof verwijderen monitor. Indien nodig kan het debiet en of was de tijd iets worden verhoogd. Voor onze experimenten was het onwenselijk om de was te gaan groter dan 10-12 minuten, omdat dit verhoogt de kans op het verliezen van vesikel-labeling door spontane exocytose gebeurtenissen die kunnen optreden, zelfs wanneer de cel in rust is. Voor De ontkleuroplossing stap werden 900 tot 1200 AP toegediend om alle gelabelde blaasjes release. Daarnaast een ander 1200-2000 AP's zijn vaak gegeven aan een basiswaarde van "afgeefbare fluorescentie", wordt gebruikt om de data te normaliseren ontkleuroplossing te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| FM 4-64 | Molecular Probes, Life Technologies | T-3166 | |
| CNQX disodium salt | Sigma-Aldrich | C-239 |
References
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
