Summary
Derivación de los precursores neuroepiteliales de células madre embrionarias (ES) las células utilizando células estromales derivadas de la actividad de inducción (SDIA).
Abstract
Células madre embrionarias tienen el potencial de diferenciarse en células de todas las capas germinales, que los convierte en una herramienta atractiva para el desarrollo de nuevas terapias. En general, la diferenciación de las células madre embrionarias sigue el concepto de generar primero las células progenitoras inmaduras, lo que puede ser propagado y diferenciarse en fenotipos celulares maduros. Esto también se aplica ES células derivadas de la neurogénesis, en el que el desarrollo de las células nerviosas después de dos pasos principales: en primer lugar, la derivación y la expansión de inmaduros precursores neuroepiteliales y la segunda, su diferenciación en células maduras neural. Un método común para producir progenitores neurales de células madre embrionarias se basa en el cuerpo embrioides (EB) la formación, lo que revela la diferenciación de las células de todas las capas germinales incluyendo neuroectodermo. Un método alternativo y más eficiente para inducir el desarrollo de células neuroepiteliales utiliza células estromales derivadas de la actividad de la inducción (SDIA), que se puede lograr mediante el cultivo de células madre embrionarias cooperación con los huesos del cráneo derivadas de la médula las células del estroma (1). Tanto, la formación de EB y SDIA, revelan el desarrollo de la roseta-como las estructuras, que se cree que se asemejan en el tubo neural y / o progenitores neurales como la cresta. Los precursores neuronales pueden ser aislados, ampliado y diferenciado aún más hasta convertirse en neuronas específicas y las células gliales con las condiciones definidas por la cultura. Aquí se describe la generación y el aislamiento de rosetas como en los experimentos de co-cultivo con la línea de células del estroma MS5 (2-5).
Protocol
Paso 1
- Placa de mitomicina-C ggrowth inhibido (10 mg / ml durante 2,5 horas) MS5 las células a una densidad de 70.000 / cm2 en recubiertos de gelatina (0,01% durante 30 minutos) 6 placas en α-MEM medios de comunicación.
- Cuando las células se unen y se han formado una monocapa (sobre el crecimiento de la noche), cambiar a SRM.
- Manualmente aislar colonias de células ES de los cultivos de células ES mediante una jeringa con una aguja de 27 G ½.
- Tritrurate las colonias con cuidado con una punta de 1 ml y una placa azul en baja densidad en el MS5 células (normalmente 2-3 colonias por placa y 6).
Nota: Las células madre embrionarias también se puede tomar de la propagación enzimática con colagenasa y tripsina.
Paso 2
- Crecen las células madre embrionarias en el MS5 alimentadores durante 14-21 días hasta roseta que contienen la formación de colonias.
Nota: los medios de comunicación cambian a menudo. Las rosetas son por lo general en los bordes exteriores de las colonias y su formación puede ser mucho mayor si 300-500 ng / ml Noggin se añade a la SRM (3). En algunos protocolos de diferenciación, SRM se pueden intercambiar con N2-A los medios de comunicación y se complementa con el crecimiento y otros factores para promover la especificación de células (2-5).
Paso 3
- Aislar y recoger las rosetas con una aguja de 27 ½ G con un microscopio.
Nota: Evite cortar y recoger el MS5 las células del estroma. Si las colonias están llenos de rosetas, también se puede aislar a toda la colonia.
Paso 4
- Aspirar los grupos de rosetas, los tritrurate cuidadosamente con la punta de 1 ml azul, y la placa que en la poli-L-ornitina (0,001%) y fibronectina (1 mg / ml) o laminina (1 mg / ml) con cubierta de 6 pozos N2-A los medios de comunicación suelen complementarse con bFGF (20 ng / ml). Las rosetas se reforma y expansión.
Nota: Para mejorar la supervivencia de las células, se puede placa pequeños grupos en las gotas para aumentar la densidad celular. Este paso también puede ser modificada por que complementa la N2-A los medios de comunicación, con un crecimiento adicional u otros factores para promover la especificación de células (2-5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo demuestra los diferentes pasos en la creación y aislamiento de células neuroepiteliales de células madre embrionarias humanas con SDIA. La aplicación de este método es múltiple y se ha utilizado en muchos protocolos para producir neuronas específicas (por ejemplo 1, 2, 5-9). Las rosetas se cree que se asemejan a las células del tubo neural con un fenotipo anterior (2, 5, 10) y también contienen células progenitoras de la cresta neural (11, 12). Además, conservan un cierto nivel de plasticidad, ya que pueden ser modelados por factores específicos en condiciones de cultivo definido. Por lo tanto, los progenitores SDIA derivados neural puede dar lugar a muchos tipos de células del sistema nervioso central y periférico que los convierte en herramienta útil para la derivación de las diferentes poblaciones de células neuronales en los paradigmas de la diferenciación de células ES.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | ||
| alpha-MEM | GIBCO, by Life Technologies | 12571 | ||
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | ||
| Knockout-DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 10829 | ||
| Knockout serum replacement | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | ||
| MEM nonessential amino acid solution | GIBCO, by Life Technologies | 12383 | ||
| DMEM/F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | ||
| N2-A supplement | Stem Cell Technologies | 07152 | ||
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich | M0503 | ||
| Gelatine type-A | Sigma-Aldrich | G1890 | ||
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | 0.01% solution | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L-2020 | ||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Invitrogen | 13256 | ||
| 1 mL Syringe with 27 1/2 G needle | BD Biosciences | 309623 | ||
| N2-A media | medium | DMEM/F12 + 1% N2-A supplement | ||
| Serum replacement media (SRM) | medium | Knockout-DMEM + 20% Knockout serum replacement +1% MEM nonessential amino acid solution + 2 mM L-glutamine | ||
| α-MEM media | medium | α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% penicillin/streptomycin | ||
| MS5 | cell line | stromal cells | ||
| Microscope | ||||
| 6-well Plates | for tissue culture |
References
- , Forthcoming.
