ES-cellerna neuroepiteliala cellkulturer

Summary

Härledning av neuroepiteliala prekursorer från embryonala stamceller (ES-celler) med hjälp av stromaceller-cellerna inducerande aktivitet (SDIA).

Abstract

ES-celler har potential att differentiera till celler från alla groddblad, vilket gör dem till ett attraktivt verktyg för utveckling av nya behandlingsmetoder. I allmänhet följer differentiering av ES-celler konceptet att först skapa omogna stamceller, som sedan kan förökas och differentieras till mogna cellulära fenotyper. Detta gäller även för ES-cellerna neurogenes, i vilken utvecklingen av neurala celler följer två viktiga steg: först härledningen och utbyggnad av omogna neuroepiteliala prekursorer och andra, deras differentiering till mogna neurala celler. En vanlig metod för att producera neurala stamceller från ES-celler är baserad på embryoid kroppen (EB) bildande, som avslöjar differentiering av celler från alla groddblad inklusive neuroectoderm. Ett alternativt och mer effektiv metod att förmå neuroepiteliala cell utveckling använder stromaceller-cellerna inducerande aktivitet (SDIA), vilket kan uppnås genom samarbete odling ES-celler med skallen härledd från benmärg stromaceller (1). Både EB bildning och SDIA, avslöjar utvecklingen av rosett-liknande strukturer, som är tänkt att likna neuralrörsdefekter-och / eller neural crest-liknande stamceller. Den neurala prekursorer kan isoleras, utökat och ytterligare differentieras till specifika nervceller och celler Glia hjälp av definierade kultur villkor. Här beskriver vi generering och isolering av dessa rosetter i samarbete kultur experiment med stromaceller cellinje MS5 (2-5).

Protocol

Steg 1

1. Plate mitomycin-C ggrowth-hämmade (10 mikrogram / ml för 2,5 timmar) MS5 celler med en täthet på 70.000 / cm2 på gelatin-belagd (0,01% i 30 minuter) 6 brunnar i α-MEM media.
2. När cellerna är anslutna och har bildat ett monolager (över natten tillväxt), övergå till SRM.
3. Manuellt isolera kolonier ES-celler från kulturer ES-celler med hjälp av en spruta med en 27 ½ G nål.
4. Tritrurate kolonierna försiktigt med en 1 ml blå spets och plattan vid låg densitet på MS5 celler (vanligtvis 2-3 kolonier per 6 brunnar).

Obs: ES-celler kan också tas från enzymatisk förökning med hjälp av kollagenas eller trypsin.

Steg 2

1. Växa ES-celler på MS5 matare för 14-21 dagar tills rosett-innehållande kolonier form.

Obs: Ändra media ofta. Den rosetter är oftast i ytterkanterna av kolonierna och deras bildning kan öka betydligt om 300-500 ng / ml Noggin läggs till SRM (3). I vissa differentiering protokoll kan SRM bytas med N2-A media och kompletteras med tillväxt eller andra faktorer för att främja cell specifikation (2-5).

Steg 3

1. Isolera och plocka rosetter med en 27 ½ G-nål i mikroskop.

Obs: Undvik att skära och plocka MS5 stromaceller. Om kolonier är packade med rosetter kan man isolera också hela kolonin.

Steg 4

1. Aspirera kluster av rosetter, tritrurate dem försiktigt med en 1 ml blå spets, och platta dem på poly-L-Ornithine (0,001%) och fibronektin (1 mikrogram / ml) eller laminin (1 mikrogram / ml)-belagda 6 brunnar i N2-A media kompletteras oftast med bFGF (20 ng / ml). Den rosetter kommer reformer och expandera.

OBS: För att öka cellöverlevnad, kan en platta de små kluster i droppar för att öka cell densitet. Detta steg kan också ändras genom att komplettera den N2-A medier med ytterligare tillväxt eller andra faktorer för att främja cell specifikation (2-5).

Discussion

Detta protokoll visar de olika stegen i att skapa och isolera neuroepiteliala celler från mänskliga ES-celler med hjälp SDIA. Tillämpningen av denna metod är många och har använts i många protokoll för att producera specificerade nervceller (t.ex. 1, 2, 5-9). Den rosetter är tänkt att likna neuralrörsdefekter celler med en främre fenotyp (2, 5, 10) och även innehålla neural crest stamceller (11, 12). Dessutom behåller de en viss nivå av plasticitet, eftersom de kan vara mönstrad med specifika faktorer i definierade odlingsbetingelser. Därmed kan SDIA-derived neurala stamceller ger upphov till många celltyper från centrala och perifera nervsystemet vilket gör dem ett användbart verktyg för härledning av olika neurala cellpopulationer i ES paradigm celldifferentiering.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
L-Glutamine		GIBCO, by Life Technologies	25030
alpha-MEM		GIBCO, by Life Technologies	12571
Penicillin/streptomycin		GIBCO, by Life Technologies	15140
Knockout-DMEM		GIBCO, by Life Technologies	10829
Knockout serum replacement		GIBCO, by Life Technologies	10828
MEM nonessential amino acid solution		GIBCO, by Life Technologies	12383
DMEM/F12		GIBCO, by Life Technologies	11330
N2-A supplement		Stem Cell Technologies	07152
Mitomycin-C		Sigma-Aldrich	M0503
Gelatine type-A		Sigma-Aldrich	G1890
poly-L-ornithine		Sigma-Aldrich	P4957	0.01% solution
Laminin		Sigma-Aldrich	L-2020
Fibronectin		Sigma-Aldrich	F2006
Basic fibroblast growth factor (bFGF)		Invitrogen	13256
1 mL Syringe with 27 1/2 G needle		BD Biosciences	309623
N2-A media	medium			DMEM/F12 + 1% N2-A supplement
Serum replacement media (SRM)	medium			Knockout-DMEM + 20% Knockout serum replacement +1% MEM nonessential amino acid solution + 2 mM L-glutamine
α-MEM media	medium			α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% penicillin/streptomycin
MS5	cell line			stromal cells
Microscope
6-well Plates				for tissue culture