Summary
的cDNA微阵列PtGen2的基因表达研究开发火炬松，
Abstract
PtGen2是一个26496的功能包含放大的火炬松松树EST序列的cDNA微阵列。松树和其他针叶树种基因的表达研究的研究人员所使用的阵列是在我们的实验室生产。 PtGen2发展作为我们的基因中发现火炬松努力的结果，并主要从根组织确定的序列组成，但也从针和干1,2 PtGen2已通过杂交不同的针叶树目标CY -染料标记的cDNA测试使用放大和非扩增间接标记的方法，也与杂交和洗涤条件进行测试。此影片的重点预杂交前后幻灯片的处理和加工，以及杂交后，用一些发达国家以前的程序进行修改。3,4还包括，只以文本形式，是为一代人所使用的协议，用于下行数据处理标签和目标的cDNA小号清理，以及对软件的信息。
PtGen2是印有一个专有的打印缓冲区，含有高浓度的盐，可很难完全消除。第一次在一个温暖的SDS溶液前预杂交幻灯片冲洗。预杂交后，幻灯片冲洗水的几个变化，积极完成拆除剩余的盐。 LifterSlips™然后清洗和幻灯片上的定位标记的cDNA仔细加载到芯片由毛细作用的方式，甚至整个幻灯片的样本分布，并减少泡沫法团的机会。杂交阵列目标是在48℃，在高湿度条件下完成。杂交后，一个标准洗涤系列53 ° C和室温延长时间。加工PtGen2使用这种技术的幻灯片，减少盐和经常看到的SDS -派生文物数组时不太严格处理。杂交从几个不同的针叶树RNA的来源派生的目标，这种处理协议取得更少的文物，减少背景，和不同的实验组阵列之间提供更好的一致性。
Protocol
（注意：1 - 4节不在视频展示）
准备CY -标记的目标基因
下面是我们使用cDNA合成火炬松总RNA和间接的基因标签芯片杂交前的协议。虽然已作出一些非平凡的修改，下面的协议是与Invitrogen公司的间接标基因标记试剂盒提供的说明书中的类似。
第1部分：第一链cDNA合成反应
- 每个套件的组件在使用前混合，并简要旋转。
- 准备反应如下：
- XμlDEPC - H 2 O
- Xμl总RNA，20微克/反应（Ambion公司的涡轮DNA酶处理）
- 2μL锚以oligo（dT）20引物（2.5μg/μl ）
- 加入1μl的随机六聚体引物
- 总体积=18μl
- 在70 ° C为5分钟，然后置于冰上1-2分钟孵育管。
- 以下内容添加到每个反应管冰：
- 6μl5X第一链缓冲
- 1.5μl0.1M数码地面电视
- 1.5μl10MM dNTP混合液
- RNaseOUT加入1μl（40U/μl）
- 2μL标III RT（400U/μl）
- 轻轻混匀，旋转简要。一夜之间管孵育45 ° C。
- 1M NaOH溶液15μl加入到每个反应管中，调匀。
- 在70 ° C孵育10分钟管。
- 1M盐酸加15μl，轻轻混匀。
- 加入20μL3M的醋酸钠（pH值5.2），轻轻混匀。
第2部分：净化第一链cDNA的。
- 载入缓冲区的cDNA（步骤1.9）中加入500μL和拌匀。
- 一个收集管上放置一个SNAP纯化柱（间接标记试剂盒提供）和负载的列上你的基因。
- 自旋14000克，在室温1分钟，丢弃流过。
- SNAP列和放置到同一个收集管加入洗涤缓冲液500μL。
- 自旋14000克，在室温1分钟，丢弃流过。
- 重复步骤2.4和2.5的三倍，共有三个500μL洗涤。
- 在14000克旋转一个更多的时间在室温1分钟的秒;丢弃流过。
- 放置到一个新的1.5毫升管的SNAP列。
- 添加温暖DEPC水（50℃）50μL的SNAP列，并在孵化室温度为1分钟列。洗脱通过自旋为1分钟的房间温度在14,000克的cDNA。
- 重复步骤2.9，使用温暖DEPC水100μL和相同的洗脱液1.5毫升管。
- 添加20μL3M的醋酸钠（pH值5.2）步骤2.9和2.10的洗脱液。
- 糖原（20mg/ml）3μl管和组合。
- 冰冷的100％的乙醇添加500μL，拌匀，和管孵育1小时，在-80 ° C。
- 14000克旋转管在4 ° C 20分钟。小心去除上清。
- 冰冷的70％的乙醇添加500μL和自旋14,000克管，在4 ° 5分钟的。小心去除上清。
- 空气干燥5分钟的样品，确保所有被删除乙醇。
- 2X耦合缓冲液温在37 ° C 5分钟，重新暂停在温暖的2X耦合缓冲液5μLcDNA样本。
- 的cDNA /耦合缓冲区的温度在50 °彗星以及10分钟和涡。确保您的cDNA颗粒在2X耦合缓冲区是完全重新悬浮。
第3部分：用荧光染料标签
准备反应时，要小心，尽量减少光的染料溶液的接触 。 此外，二甲基亚砜是吸湿性，会吸收空气中的水分，这将与染料NHS酯反应，并大大降低耦合反应效率 。 保持琥珀色的螺丝帽小瓶于-20 ° C试剂盒中提供的二甲基亚砜，让小瓶开放前，以防止结露温至室温。只能使用本试剂盒提供的二甲基亚砜 。
- 打开一包CY - 3或CY - 5染料和直接添加二甲基亚砜75μl染料小瓶。
- 新增的二甲基亚砜/染料溶液5μL步骤2.18管。
- 充分混匀，室温在黑暗中孵育1小时管。
- 加入20μL3M的醋酸钠（pH值5.2）的染料耦合的cDNA解决方案。
- 加入500μL样缓冲的cDNA的解决方案。由涡旋混合。
- 放置到一个明确的收集管中的管理单元列和负载的cDNA /缓冲液。
- 自旋14000克，在室温1分钟，丢弃流过。
- 放在同一个集合的SNAP列管;洗涤缓冲液500μL添加到列。
- 自旋14000克，在室温1分钟，丢弃流过。
- 重复步骤3。 8-3.9 3次，共有三个500μL洗涤。
- 在14000克旋转一个更多的时间在室温1分钟，丢弃流过。
- 放置到一个新的琥珀收集管的SNAP列。
- 添加温暖DEPC水（50℃）65μl的SNAP列，并在室温下孵育1分钟。
- 旋转14000 克在室温1分钟，收集流过。流过，应该包含您的纯化染料耦合的cDNA60μl。
第4部分：评估的标记过程。
- 行为分光光度计的检测，以评估每个CY - cDNA的标签。计算合成cDNA pmol总数：外径260 ×卷。 x37ng/μl× 10 3毫微克/ PG] / 324.5 pg / pmol的。计算每个标记反应纳入CY -染料的总pmol：pmol Cy3标记= [ 外径550 X卷] / 0.15; pmol Cy5的= [OD 650 ×卷] / 0.25 。下一步，计算每个反应核苷酸/ pmol染料比率pmol。最优反应生成> 6000pmol的基因（每60ul），CY - 200pmol染料（每60ul），核苷酸/染料比<30。
第5部分：幻灯片预洗
- PtGen2阵列上印有康宁UltraGaps幻灯片（氨基硅烷涂层）和cDNA的紫外线交联。打印点都清晰可见，由于缓冲区的含盐量高。
- 使用钻石尖端的笔，以纪念幻灯片的打印区域（可选）的上限和下限的地区。
- 投入约250毫升预热到43 ° C 0.2％SDS到显微镜玻片洗菜（3“× 4”）的解决方案。
- 广场幻灯片预杂交在幻灯片机架和投身到SDS溶液非常积极的15-20倍删除幻灯片上的盐。
- 使用镊子，小心地从机架中删除的幻灯片，并放置在一个Coplin包含预杂交液（5X SSC，0.1％SDS，1％BSA）的JAR已预热至43 ° C在43 ° C孵育至少一小时。
第6部分：预杂交
- 设置五个幻灯片洗碗，每次充满millipure DH 2 O，和一个Coplin JAR充满分子级异丙醇。广场的幻灯片，在幻灯片机架，五菜过程中，通过连续扣篮20次。
- 删除幻灯片在两个时间从第五清水洗净，浸5-6倍，在幻灯片中的异丙醇，并立即到幻灯片离心（Chipmate台式，2个职位）和自旋为1分钟干。
- 通过0.22微米滤芯过滤用压缩空气清洁幻灯片和他们面临的一个基因组的解决方案杂交商会与酒吧代码。
- 清洁LifterSlips™过滤空气和朝下的白色条状幻灯片的位置。使用黄色吸管尖轻轻地对齐幻灯片上的升降机滑（70％的乙醇洗涤LifterSlips™首先是可选的。我们发现它是不必要的。）
第7部分：杂交
应在黑暗或光线较暗的开展。
- 对于每一个将杂交幻灯片，计算金额的CY - 5和CY - 3标记的cDNA给每个目标的50 75pmol。合并成一个单管的金额在37-45在真空干燥器中干燥热定型° C。完全避免干燥！
- 在60ml的杂交缓冲液重悬的干探头（新鲜那天）和涡简要。
- 孵育在95℃的浴缸和30秒快速离心5分钟，悬浮的cDNA。
- 载入缓慢幻灯片LifterSlip™交界处的底部的幻灯片（条形码完）吹打整个悬浮探头量。幻灯片将载入毛细作用的方式。 （有些人喜欢吸管上的幻灯片，然后轻轻地覆盖LifterSlip™这是一个一杆的方法，因为如果你得到气泡不能移动后的位置，从而导致现货涂抹文物LifterSlip™）
- 100mm的数码地面电视将20uL到每个湿度以及位于香港总商会的两端。
- 广场上腔的顶部，并拧紧凸轮螺丝。盖到48℃的水浴12-18小时，轻轻摇动，在50-60转用铝箔和沉浸室。
第8部分：杂交后洗
所有清洗液应在黑暗或光线较暗的开展 。 幻灯片不应该被允许干，直到最后一步。
- 设置之一：1）宽充满清洗液＃1 @ 53 ° C，和4个滑动洗碗充满的每250毫升以下的Coplin JAR灰解决方案＃1 @ 53 ° C，2）洗涤液＃2 @室温，3＆4）两道菜含有清洗液＃3 @室温。
- 小心取出杂交商会的幻灯片，并将其放置在到Coplin JAR他们两个。离开30秒，然后抬起幻灯片慢慢和升降机滑仍将在罐子。放置幻灯片在幻灯片架，并立即浸入到清洗液＃1（1X SSC，0.2％SDS，预热到43 ° C）。重复，直到所有LifterSlips被删除，所有要洗的幻灯片，在洗涤液＃1碟。投身机架10倍上下大力。
- 地点菜在53 °空中摇晃10分钟的转速在50-100摇床中的C。
- 传输机架在室温下清洗解决方案＃2（0.1X SSC，0.2％SDS），暴跌10倍，并培育，缓慢摇晃10分钟。
- 浸机架到先洗解决方案＃3（0.1X SSC）的15倍，以消除任何残留的SDS进行清洗液＃2。第二次洗涤液放置在机架＃3盘，大跌10倍，然后缓慢摇晃10分钟。
- 配备摆动桶转子放置在50毫升猎鹰上限管和离心旋转@ 1500转幻灯片。删除幻灯片光隔音容器，我们使用另一个猎鹰管，用铝箔覆盖，并清除管内的空气与氮气，紧紧第（这样可以减少在夏季氧化的Cy染料，特别是CY - 5时，臭氧的水平最高的）。幻灯片可以存储在扫描中的氮清除管前几个小时，然而，获得最佳的信号效果，清洗后立即进行扫描时。
第9部分：数据收集和统计分析
- 扫描图像数据的收集上珀金埃尔默ScanArray。我们使用10微米扫描设置和平衡Cy3标记和Cy5信号使用为制造商的指示线的调整方法。
- TIF文件是网格和原始信号数据的收集和筛选ImaGene版本7.5（生物发现，公司，El Segundo的，CA）
- 数据标准化和评估，以确定有效的统计差异表达的物种与BRB阵列工具版本。 3.7。
- 模式分析，以方便协调基因表达的决心，是与基因表达模式分析软件（GEPAS）版。 3.1。
图1 PtGen2处理数组使用此protoco 湖的例子 。
图2：使用标准的杂交和洗涤协议处理PtGen2数组的例子。
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Discussion
PtGen2是最近发展起来的，定制的cDNA微阵列技术，主要是设计用来火炬松研究社会。迄今产生的初步结果表明数组是一个有价值的工具，在转录事件，在干旱胁迫反应的发生，以及在监测胚胎发育过程中发生的变化，在海上松 ，马尾松松树5,6我们的评价最近还证明PtGen2工程，以及在跨物种杂交利用多元化的针叶树属孤立的目标样本。变得越来越松和其他针叶树种在研究基因表达的研究人员利用5作为PtGen2，这个培训视频应提供必要的技术基础，以质量和可重复性的数据。在我们的手中，PtGen2取得了较好的效果比通常芯片的工作就业者，更严格的杂交和洗涤协议处理时。其他的方法来处理PtGen2阵列已经成功，但缺乏一致性。以下这里描述的技术步骤将有助于提高一致性，尤其是在处理大量的阵列，也将有助于极大地减少和消除不必要的文物和高背景。
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Acknowledgments
的标签，杂交，洗涤协议本文包含一些修改，而在基因组研究所（TIGR），肖恩 - 利维博士范德比尔特芯片共享资源（VMSR）研究所博士J. Quackenbush以前开发的博士和罗布阿尔巴而博伊斯汤普森研究所（BTI）的康奈尔大学。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Pre-hybridization Buffer | Buffer | 5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA | ||
| Hybridization Buffer | Buffer | 30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS | ||
| Wash Solution #1 | Buffer | 1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C | ||
| Wash Solution #2 | Buffer | 0.1X SSC, 0.2% SDS | ||
| Wash Solution #3 | Buffer | 0.1X SSC | ||
| Isopropyl Alcohol | Reagent | Sigma-Aldrich | 34959-2.5L | |
| 50mL Conical Tubes | Other | Falcon BD | 352070 | |
| 15mL Conical Tubes | Other | Falcon BD | 352196 | Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation |
| Coplin Jar | Wheaton | 900520 | ||
| Staining Dish & Rack | Other | Wheaton | 900200 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Other | Sigma-Aldrich | A-9418 | |
| PolyA RNA | Invitrogen | POLYA.GF | ||
| SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling | Kit | Invitrogen | L1014-02 | |
| Turbo DNase | Kit | Ambion | AM1907 | |
| System | ||||
| Cy-5 Dye | Reagent | GE Healthcare | PA25001 | |
| Cy-3 Dye | Reagent | GE Healthcare | PA23001 | |
| LifterSlips™ | Other | Erie Scientific | 25X601 | |
| HybChambers | Equipment | GeneMachines | JHYB200003 |
References
- Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
- Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. unpublished data. , Forthcoming.
- Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques. 29, 548-562 (2000).
- Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development. The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).
- Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray. IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. August 25-29, Quebec City, Quebec, , (2008).
- Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. September 24-27, Albena, Bulgaria, , (2008).
