Summary
Il cDNA microarray PtGen2 stato sviluppato per studi di espressione genica in pino loblolly,
Abstract
PtGen2 è una caratteristica del DNA microarray 26.496 contenente amplificato EST pino loblolly. La serie è prodotta nel nostro laboratorio per l'utilizzo da parte di ricercatori studiando l'espressione genica in specie di pino ed altre conifere. PtGen2 è stato sviluppato come risultato degli sforzi gene nostra scoperta in pino loblolly, ed è composto da sequenze identificate principalmente dai tessuti radice, ma anche da ago e staminali. 1,2 PtGen2 è stato testato da ibridare differenti Cy-dye etichettati cDNA bersaglio di conifere , utilizzando sia amplificato e non amplificati modalità di etichettatura indiretti, e anche testato con una serie di condizioni di ibridazione e di lavaggio. Questo video si concentra sulla gestione e l'elaborazione di diapositive prima e dopo la pre-ibridazione, così come dopo ibridazione, con alcune modifiche alle procedure sviluppate in precedenza. 3,4 inclusi anche, in forma di testo unico, sono i protocolli utilizzati per la generazione, l'etichettatura e la pulizia di s cDNA bersaglio, così come informazioni sul software utilizzato per l'elaborazione dei dati a valle.
PtGen2 è stampato con un buffer di stampa proprietario che contiene alte concentrazioni di sale che possono essere difficili da rimuovere completamente. I vetrini vengono lavati prima di una soluzione calda SDS prima di pre-ibridazione. Dopo la pre-ibridazione, le diapositive vengono lavati con vigore in diversi cambiamenti di acqua per completare la rimozione dei sali rimanenti. LifterSlips ™ sono quindi puliti e posizionati sul diapositive e cDNA marcato è attentamente caricati sul microarray per mezzo di un'azione capillare che prevede anche la distribuzione del campione lungo la diapositiva e riduce la possibilità di incorporazione bolla. Ibridazione degli obiettivi alla matrice avviene a 48 ° C in condizioni di elevata umidità. Dopo l'ibridazione, una serie di lavaggi standard sono fatto a 53 ° C e temperatura ambiente per tempi prolungati. Elaborazione PtGen2 diapositive utilizzando questa tecnica riduce sale e SDS-derivati artefatti spesso visto quando l'array è un'elaborazione meno rigorosamente. Ibridazione obiettivi derivanti da diverse fonti diverse conifere RNA, questo protocollo di elaborazione prodotto un minor numero di artefatti, sfondo ridotto, e ha fornito una migliore coerenza tra i diversi gruppi sperimentali di array.
Protocol
(Nota sezioni 1 - 4 Non dimostrato in video)
Preparazione Cy-etichetta target cDNA
Quello che segue è il protocollo che usiamo per la sintesi di cDNA da RNA pino loblolly totale e indiretta etichettatura cDNA microarray prima di ibridazioni. Anche se pochi, non banali sono state apportate modifiche, il protocollo sottostante è simile a quello nel manuale di istruzioni fornito con il kit SuperScript Invitrogen indiretta Etichettatura cDNA.
Parte 1: Prima Strand reazione di sintesi del DNA
- Mescolare e girare brevemente ogni componente del kit prima dell'uso.
- Preparare le reazioni come segue:
- Xμl DEPC-H 2 O
- Xμl RNA totale, 20 mcg / reazione (pretrattati con Ambion Turbo DNasi)
- 2μl Ancorato Oligo (dT) 20 Primer (2.5μg/μl)
- 1ml Primer esamero casuale
- Volume totale = 18μl
- Incubare le provette a 70 ° C per 5 minuti, e poi posto in ghiaccio per 1-2 minuti.
- Aggiungere quanto segue ogni tubo di reazione sul ghiaccio:
- 6μl 5X First-Strand tampone
- 1.5μl 0.1M DTT
- 1.5μl 10mM dNTP mix
- 1ml RNaseOUT (40U/μl)
- 2μl SuperScript III RT (400U/μl)
- Mescolare delicatamente e centrifugare brevemente. Incubare la provetta in una notte a 45 ° C.
- Aggiungere 15μl di NaOH 1M per ogni tubo di reazione e mescolare accuratamente.
- Incubare la provetta a 70 ° C per 10 minuti.
- Aggiungere 15μl di HCl 1M, mescolare delicatamente.
- Aggiungere 20μl acetato di sodio 3M (pH 5.2); mescolare delicatamente.
Parte 2: Purificante First-Strand cDNA.
- Aggiungere 500μl di tampone di caricamento per il cDNA (dal punto 1.9) e mescolare bene.
- Inserire una colonna di purificazione SNAP (fornito con il kit etichettatura indiretta) su un tubo di raccolta e caricare i vostri cDNA sulla colonna.
- Spin a 14.000 g a temperatura ambiente per 1 minuto; scartare il flow-through.
- Posizionare la colonna SNAP sul tubo stessa collezione e aggiungere 500μl di tampone di lavaggio.
- Spin a 14.000 g a temperatura ambiente per 1 minuto; scartare il flow-through.
- Ripetere i punti 2.4 e 2.5 per tre volte, per un totale di tre lavaggi 500μl.
- Spin ancora una volta a 14.000 g a temperatura ambiente per minuto sec 1; scartare il flow-through.
- Posizionare la colonna SNAP su un nuovo tubo 1,5 ml.
- Aggiungere 50μl di caldo DEPC-acqua (50 ° C) alla colonna e colonna SNAP incubare a temperatura ambiente per 1 minuto. Eluire il cDNA tramite uno spin a 14.000 g a temperatura ambiente per 1 minuto.
- Ripetere il punto 2.9, con 100μl di caldo DEPC acqua e il tubo stesso 1,5 ml per l'eluente.
- Aggiungere 20μl di acetato di sodio 3M (pH 5.2) per l'eluente passi da 2.9 e 2.10.
- Aggiungi 3μl di glicogeno (20mg/ml) per il tubo e mescolare.
- Aggiungere 500μl di ghiaccio freddo EtOH 100%, mescolare bene e incubare la provetta per 1 ora a -80 ° C.
- Rotazione del tubo a 14.000 g a 4 ° C per 20 minuti. Rimuovere con attenzione il sopranatante.
- Aggiungere 500μl di ghiacciata EtOH 70% e ruotare il tubo a 14.000 g a 4 ° C per 5 minuti. Rimuovere con attenzione il sopranatante.
- Far asciugare il campione per 5 minuti; garantire che tutte le EtOH viene rimosso.
- Scaldare il buffer 2X accoppiamento a 37 ° C per 5 minuti e risospendere il campione in cDNA 5μl di caldo Buffer accoppiamento 2X.
- Riscaldare il cDNA / buffer di accoppiamento a 50 ° C per 10 minuti e vortice bene. Assicurarsi che il cDNA pellet è completamente risospeso nel tampone di accoppiamento 2X.
Parte 3: Etichettatura con colorante fluorescente
Nel preparare la reazione, fare attenzione a minimizzare l'esposizione della soluzione colorante alla luce. Inoltre, DMSO è igroscopico e assorbe l'umidità dall'aria, che reagisce con l'estere NHS del colorante e ridurre significativamente l'efficienza di reazione di accoppiamento. Tenere il DMSO fornito nel kit in un tappo a vite ambra fiala a -20 ° C, e lasciare che il flacone a temperatura ambiente prima di aprire per evitare la condensa. Usare solo il DMSO fornito con questo kit.
- Aprire un pacchetto di Cy-3 o Cy-5 Dye e aggiungere 75μl di DMSO direttamente nel flacone colorante.
- Aggiungere 5μl della soluzione di DMSO / colorante per il tubo dal punto 2.18.
- Mescolare bene e incubare il tubo a temperatura ambiente al buio per 1 ora.
- Aggiungere 20μl di acetato di sodio 3M (pH 5.2) per la soluzione colorante accoppiata cDNA.
- Aggiungere 500μl di tampone di caricamento per la soluzione di cDNA. Mescolare bene nel vortex.
- Inserire una colonna SNAP su un tubo di raccolta chiara e caricare la soluzione di cDNA / tampone.
- Spin a 14.000 g a temperatura ambiente per 1 minuto; scartare il flow-through.
- Posizionare la colonna SNAP sulla stessa collezionetubo, aggiungere 500μl di soluzione di lavaggio colonna.
- Spin a 14.000 g a temperatura ambiente per 1 minuto; scartare il flow-through.
- Ripetere i passaggi 3. 8-3,9 tre volte, per un totale di tre lavaggi 500μl.
- Spin ancora una volta a 14.000 g a temperatura ambiente per 1 minuto; scartare il flow-through.
- Posizionare la colonna SNAP su un nuovo tubo di raccolta ambra.
- Aggiungere 65μl di caldo DEPC-acqua (50 ° C) per la colonna SNAP e incubare a temperatura ambiente per 1 minuto.
- Spin a 14.000 g a temperatura ambiente per 1 minuto e raccogliere il deflusso. Il flusso attraverso dovrebbe contenere 60μl del vostro purificato dye-accoppiato cDNA.
Parte 4: Valutazione della procedura di etichettatura.
- Condurre un test spettrofotometro per valutare ogni Cy-cDNA etichettatura. Calcolare il numero totale di pmol di cDNA sintetizzato: [OD 260 x vol. x 37ng/μl x 10 3 ng / pg] / 324,5 pg / pmol. Calcolare il totale di pmol incorporato Cy-Dye per ogni reazione di marcatura: pmol Cy3 = [OD 550 X vol.] / 0,15; pmol Cy5 = [OD 650 X vol.] / 0,25. Successivamente, calcolare la pmol di nucleotidi / pmol rapporto colorante per ogni reazione. Reazioni ottimale generare 6000pmol> di cDNA (per 60ul),> 200pmol di Cy-Dye (per 60ul), e un rapporto di nucleotidi / colorante che è <30.
Parte 5: Presentazione Pre-Wash
- Array PtGen2 è stampato su Corning diapositive UltraGaps (amino-silano rivestito) e cDNA sono UV-reticolato. Macchie di stampa sono chiaramente visibili a causa del contenuto di sale del buffer.
- Utilizzare una penna a punta di diamante per segnare la diapositiva per le aree superiore e inferiore dell'area di stampa (opzionale).
- Mettere circa 250mL pre-riscaldato a 43 ° C soluzione allo 0,2% SDS nel lavare i piatti vetrino da microscopio (3 "x 4").
- Collocare i vetrini per essere pre-ibridato nel rack diapositive e immergersi nella soluzione di SDS 15-20 volte molto energicamente per rimuovere i sali nelle diapositive.
- Prendere con cautela rimuovere le diapositive dal rack e metterli in una vaschetta Coplin contenente Pre-ibridazione Buffer (5X SSC, 0,1% SDS, 1% BSA) che è stato pre-riscaldato a 43 ° C. Incubare a 43 ° C per almeno un'ora.
Parte 6: Pre-ibridazione
- Impostare fino a cinque piatti scivolare lavaggio, ognuno dei quali contiene millipure dH 2 O, e una vaschetta Coplin piena molecolare grado isopropanolo. Porre i vetrini in un rack di diapositive e di processo in modo sequenziale attraverso cinque piatti da inzuppare 20 volte ciascuno.
- Rimuovere diapositive due alla volta dal lavaggio con acqua quinto e tuffo 5-6 volte al posto isopropanolo e immediatamente nelle diapositive in microcentrifuga diapositive (da banco Chipmate, 2 posizioni) e spin 1 minuto ad asciugare.
- Vetrini puliti con aria compressa filtrata attraverso una cartuccia filtrante 0,22 mM e metterli con il codice a barre rivolto verso l'alto in un Genomic Hybridization Camera Solutions.
- LifterSlips Clean ™ con aria filtrata e posizionarli nelle diapositive con le strisce bianche verso il basso. Utilizzare una punta di giallo pipetta per allineare scivolare delicatamente il sollevatore sul vetrino (lavaggio LifterSlips ™ prima in etanolo al 70% è facoltativo. Abbiamo trovato non sia necessario.)
Parte 7: ibridazione
Deve essere effettuata alla luce scura o bassa.
- Per ogni diapositiva di essere ibridato, calcolare la quantità di Cy-5-3 e Cy cDNA marcato per dare 50-75pmol di ciascun target. Combinare tali importi in un unico tubo e asciutto in un essiccatore a vuoto con l'impostazione di calore a 37-45 ° C. Evitare di asciugare completamente!
- Risospendere le sonde secco in tampone di ibridazione da 60 ml (fatto fresco quel giorno) e mescolare brevemente nel vortex.
- Incubare il cDNA risospeso per 5 minuti in un bagno di 95 ° C e poi microcentrifuga veloce per 30 secondi.
- Carico l'intero volume della sonda risospeso lentamente pipettamento a slide-LifterSlip ™ incrocio nella parte inferiore (fine codice a barre) della diapositiva. La slitta si caricherà attraverso l'azione capillare. (Alcuni preferiscono pipetta alla diapositiva e poi delicatamente la sovrapposizione LifterSlip ™ questo è un metodo di colpo perché se si ottiene bolle non è possibile spostare l'™ LifterSlip dopo il posizionamento che può portare a posto artefatti sbavature)
- 20 ul luogo di DTT 100mM in ogni umidità ben posizionato alle estremità della camera.
- Posizionare la parte superiore sulla camera e stringere le viti della camma. Coprire la camera con un foglio di alluminio e immergere in un bagno d'acqua ° 48 C per 12-18 ore con agitazione a 50-60 giri al minuto.
Parte 8: Post-ibridazione lava
Tutti i lavaggi devono essere effettuati nel buio o in luce scarsa. Diapositive non dovrebbe mai essere permesso per asciugare fino alla fase finale.
- Impostare una vaschetta Coplin piena di soluzione di lavaggio # 1 @ 53 ° C, e quattro piatti di far scorrere il lavaggio pieno di 250 ml di ciascuna delle seguenti: 1) Wcenere Soluzione # 1 @ 53 ° C, 2) la soluzione di lavaggio # 2 @ temperatura ambiente, 3 e 4) due piatti contenenti soluzione di lavaggio # 3 @ temperatura ambiente.
- Rimuovere con attenzione le diapositive dalla camere di ibridazione e metterli due per volta nel vaso Coplin. Lasciare agire per 30 secondi, quindi sollevare il sfilare lentamente e la polizza di sollevatore rimarrà nel barattolo. Collocare i vetrini nel rack diapositive e subito immergere in soluzione di lavaggio # 1 (1X SSC, 0,2% SDS, preriscaldamento a 43 ° C). Ripetere fino a quando tutti LifterSlips vengono rimossi e tutte le diapositive da lavare sono nella soluzione di lavaggio # 1 piatto. Tuffo a rack su e giù per 10 volte con vigore.
- Piatto posto a 53 ° C in aria shaker con agitazione a 50-100 rpm per 10 minuti.
- Trasferimento rack per la soluzione di lavaggio # 2 (0,1 X. SSC, 0,2% SDS), tuffo 10 volte, e incubare a temperatura ambiente, agitando lento per 10 minuti.
- Tuffo a rack 15 volte nella soluzione di lavaggio primo # 3 (0,1 X. SSC) per rimuovere eventuali residui SDS riporto dalla soluzione di lavaggio # 2. Cremagliera posto nella soluzione di lavaggio # 3 secondo piatto, immergersi per 10 volte, e poi lenta agitazione per 10 minuti.
- Collocare i vetrini in 50mL tubi Falcon innevate e spin @ 1.500 giri in centrifuga dotato di un rotore oscillante. Rimuovere diapositive alla luce contenitore impermeabile, usiamo un altro tubo Falcon coperto con un foglio di alluminio e eliminare l'aria dal tubo con gas di azoto, il tappo (che riduce l'ossidazione dei coloranti Cy, specialmente Cy-5 in estate, quando i livelli di ozono sono più alti ). Le diapositive possono essere conservati per un paio d'ore prima della scansione nei tubi di azoto eliminato, tuttavia, i risultati migliori si ottengono quando il segnale di scansione viene effettuata immediatamente dopo il lavaggio.
Parte 9: Raccolta dati e analisi statistica
- Dati delle immagini di scansione è raccolto su un ScanArray PerkinElmer. Usiamo una impostazione di scansione 10 micron ed equilibrio Cy3 e Cy5 segnali utilizzando il metodo di regolazione linea secondo le istruzioni del produttore.
- TIF sono griglia e dati del segnale grezzi raccolti e filtrati con ImaGene versione 7.5 (BioDiscovery, Inc., El Segundo, CA)
- Normalizzazione dei dati e la valutazione per determinare statisticamente validi specie espressi in modo differenziale si fa con BRB Array strumenti Ver. 3.7.
- Analisi di modelli per facilitare la determinazione di geni espressi coordinatamente è fatto con il software analisi di espressione genica Pattern (GEPAS) Ver. 3.1.
Figura 1. Esempio di PtGen2 serie elaborati utilizzando questa l. protoco
Figura 2. Esempio di PtGen2 serie trattati mediante ibridazione standard e protocolli di lavaggio.
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Discussion
PtGen2 è sviluppata di recente, cDNA microarray personalizzati che è stato progettato per essere utilizzato principalmente dalla comunità di ricerca loblolly pino. I risultati preliminari generato finora hanno mostrato l'array di essere un valido strumento nella valutazione degli eventi trascrizionale che si verificano in risposta a stress idrico, così come nel monitoraggio dei cambiamenti che si verificano durante lo sviluppo embrionale in pino marittimo, Pinus pinaster 5,6 Abbiamo inoltre recentemente dimostrato che PtGen2 funziona bene in ibridazioni specie di croce con campioni mirati isolato da una vasta gamma di generi di conifere. PtGen2 5 Come diventa sempre più utilizzato dai ricercatori studiando l'espressione genica in Pinus e di altre specie di conifere, il video formazione dovrebbe fornire loro il necessario tecniche base per generare dati di qualità e riproducibili. Nelle nostre mani, PtGen2 ha dato migliori risultati quando sono trattati dalle più ibridazione rigorosi protocolli di lavaggio e di quelli tipicamente impiegati in lavori microarray. Altri approcci al trattamento della matrice PtGen2 hanno avuto successo, ma mancava di coerenza. Seguendo le istruzioni tecniche descritte qui contribuirà ad aumentare la coerenza, in particolare durante l'elaborazione di un gran numero di array, e aiuterà anche a ridurre notevolmente ed eliminare gli artefatti indesiderati e sfondi alta.
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Acknowledgments
L'etichettatura, ibridazione, e protocolli di lavaggio nel presente documento contiene alcune modifiche a quelli sviluppati in precedenza dal Dr. J. Quackenbush mentre presso l'Institute for Genomic Research (TIGR), il dottor Shawn Levy al Microarray Vanderbilt Shared Resource (VMSR), e il Dr. Rob Alba mentre al Boyce Thompson Institute, (ITV) Cornell University.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Pre-hybridization Buffer | Buffer | 5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA | ||
| Hybridization Buffer | Buffer | 30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS | ||
| Wash Solution #1 | Buffer | 1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C | ||
| Wash Solution #2 | Buffer | 0.1X SSC, 0.2% SDS | ||
| Wash Solution #3 | Buffer | 0.1X SSC | ||
| Isopropyl Alcohol | Reagent | Sigma-Aldrich | 34959-2.5L | |
| 50mL Conical Tubes | Other | Falcon BD | 352070 | |
| 15mL Conical Tubes | Other | Falcon BD | 352196 | Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation |
| Coplin Jar | Wheaton | 900520 | ||
| Staining Dish & Rack | Other | Wheaton | 900200 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Other | Sigma-Aldrich | A-9418 | |
| PolyA RNA | Invitrogen | POLYA.GF | ||
| SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling | Kit | Invitrogen | L1014-02 | |
| Turbo DNase | Kit | Ambion | AM1907 | |
| System | ||||
| Cy-5 Dye | Reagent | GE Healthcare | PA25001 | |
| Cy-3 Dye | Reagent | GE Healthcare | PA23001 | |
| LifterSlips™ | Other | Erie Scientific | 25X601 | |
| HybChambers | Equipment | GeneMachines | JHYB200003 |
References
- Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
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- Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques. 29, 548-562 (2000).
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