Summary
cDNA microarray PtGen2은 로블롤리 파인의 유전자 발현 연구를 위해 개발되었습니다
Abstract
PtGen2이 증폭 로블롤리 파인 에스트을 포함하는 26,496 기능 cDNA microarray입니다. 배열은 소나무와 다른 침엽수 종의 유전자 발현을 연구 연구자가 사용하는 우리 실험실에서 생산됩니다. PtGen2는 로블롤리 파인 우리의 유전자 발견 노력의 결과로 개발되었고, 주로 뿌리 조직에서 식별 시퀀스로 구성되어 있습니다,뿐만 아니라 바늘과 줄기에서. 1,2 PtGen2 서로 다른 레이블 싸이 염색 코니퍼 대상 cDNAs을 hybridizing하여 테스트되었습니다 모두 증폭이 아닌 증폭 간접 라벨링 방법을, 또한 하이브 리다이 제이션 및 세척 조건의 번호와 테스트 사용합니다. 이 비디오는 이전에 개발 절차에 일부 수정을 사용하여뿐만 하이브리드화 후로 사전 하이브리드화 전후 슬라이드의 취급 및 처리에 초점을 맞추고 있습니다. 3,4도 포함, 텍스트 형식에만 생성에 사용되는 프로토콜 있으며, 레이블 및 대상 cDNA s의 청소뿐만 아니라 소프트웨어에 대한 정보는 다운 스트림 데이터 처리에 사용.
PtGen2 완전히 제거하기 어려울 수 있습니다 소금의 높은 농도를 포함하는 독점 인쇄 버퍼와 함께 인쇄됩니다. 슬라이드는 미리 하이브리드화하기 전에 따뜻한 SDS 솔루션에 처음 세탁 있습니다. 사전 하이브리드화 후 슬라이드는 남은 염분의 제거를 완료하기 위해 물을 몇 가지 변경 사항 적극적으로 씻어 수 있습니다. LifterSlips ™는 다음 청소 및 슬라이드에 위치하고 cDNA로 분류하는 것은 신중 아르 슬라이드에 걸쳐 샘플에도 유통 제공하는 모세관 작용의 방법으로 microarray에로드하고, 거품 설립의 기회를 줄일 수있다. 배열에 목표의 하이브 리다이 제이션은 48 ° C에서 높은 습도 조건에서 이루어집니다. 하이브리드화 후, 표준 세척 일련의는 53에서 완료 ° C 및 확장 시간을위한 실내 온도. 이 기술을 이용하여 처리 PtGen2 슬라이드 소금을 줄이고 SDS - 파생 유물 자주 배열이 덜 엄격하게 처리되면 보았다. 여러 코니퍼 RNA 소스에서 파생된 목표를 Hybridizing이 처리 프로토콜 적은 유물 감소 배경을 굴복하고, 배열의 다른 실험 그룹 간의 더 나은 일관성을 제공했습니다.
Protocol
(참고 제 1-4 비디오 시연되지 않음)
싸이 - 라벨 대상 cDNA 준비
어떤 다음은 우리가 hybridizations를 microarray하기 전에 로블롤리 파인 총 RNA 및 cDNA 간접 라벨에서 cDNA 합성을 위해 사용하는 프로토콜입니다. 몇 아닌 사소한 수정이되었습니다 있지만, 아래의 프로토콜 Invitrogen의 어깨 간접 cDNA 라벨링 키트와 함께 제공된 설명서에서 비슷합니다.
1 부 : 첫 번째 - 스트랜드 cDNA 합성 반응
- 믹스와 간단히 사용하기 전에 각각의 키트 구성 요소를 스핀.
- 다음과 같이 반응 준비 :
- Xμl DEPC - H 2 O
- Xμl 총 RNA 20 μg / 반응 (앰비온의 터보 DNase와 pretreated)
- 2μl 닻을 Oligo (DT) 20 프리머 (2.5μg/μl)
- 1μl 랜덤 Hexamer 프라이머
- 총 볼륨 = 18μl
- 70 1-2분 위해 얼음 ° 후 5 분 C, 장소에서 튜브를 품어.
- 얼음 각 반응 관에 다음 추가 :
- 6μl 5 배 첫 번째 - 스트랜드 버퍼
- 1.5μl 0.1M DTT
- 1.5μl 10mM dNTP 혼합
- 1μl RNaseOUT (40U/μl)
- 2μl 어깨 III RT (400U/μl)
- 부드럽게 믹스와 짧게 스핀. 45 박 튜브를 품어 ° C.
- 각 반응 관에 1M NaOH의 15μl를 추가하고 철저히 섞는다.
- 10 분 70 ° C에서 튜브를 품어.
- 1M HCL의 15μl를 추가, 부드럽게 섞는다.
- 20μl 3M의 아세트산 나트륨 (산도 5.2) 추가, 가볍게 섞는다.
2 부 : 퓨리화잉 첫째 - 스트랜드 cDNA.
- (단계 1.9에서) cDNA에 버퍼를로드 중 500μl를 추가하고 잘 섞는다.
- 컬렉션 튜브에 스냅 정화 열 (간접 라벨링 키트와 함께 제공된) 장소 및 열에 cDNA를로드합니다.
- 1 분 상온에서 1만4천그램에서 스핀하며 흐름을 통해 폐기하십시오.
- 같은 컬렉션 튜브에 SNAP 칼럼을 놓고 씻으 버퍼의 500μl를 추가합니다.
- 1 분 상온에서 1만4천그램에서 스핀하며 흐름을 통해 폐기하십시오.
- 세 500μl 세척의 총 단계 2.4 및 2.5을 세 번 반복합니다.
- 일분 잠깐 실온에서 14,000g에서 한 번 더 돌려, 흐름을 통해 폐기하십시오.
- 새로운 1.5ml 튜브에 스냅 열 놓으십시오.
- SNAP 칼럼 1 분간 온도는 실온에서 품어 컬럼에 따뜻한 DEPC - 물 (50 ° C)의 50μl를 추가합니다. 1 분 온도는 실온에서 1만4천그램에서 스핀을 통해 cDNA를 Elute.
- DEPC - 물이 따뜻하고의 100μl와 eluent에 대해 동일한 1.5ml 튜브를 사용하여, 단계 2.9를 반복합니다.
- 단계 2.9 및 2.10에서 eluent로 3M의 아세트산 나트륨의 20μl (산도 5.2) 추가합니다.
- 튜브 및 혼합에 글리코겐 (20mg/ml)의 3μl를 추가합니다.
- 얼음처럼 차가운 100 % EtOH의 500μl를 추가 잘 혼합하고, -80 1 시간 동안 튜브를 품어 ° C.
- 4 14,000g에서 튜브를 스핀 ° C를 20 분. 조심스럽게 뜨는을 제거합니다.
- 얼음처럼 차가운 70 % EtOH의 500μl를 추가하고 4 1만4천그램에서 튜브를 스핀 ° C를 오분하십시오. 조심스럽게 뜨는을 제거합니다.
- 5 분 샘플을 공기 건조, 모든 EtOH가 제거되었는지 확인합니다.
- 5 분 37 ° C를 2X 커플링 버퍼 따뜻하고 따뜻한 2X 커플링 버퍼의 5μl에서 cDNA 샘플을 다시 일시 중지합니다.
- 50 cDNA / 커플링 버퍼를 가열 ° 10 분 와동에 대한 C 음. 귀하의 cDNA 펠렛 완전히 2X 커플링 버퍼에 다시 일시 중지되었는지 확인하십시오.
3 부 : 형광 염료와 라벨링
반응을 비교할 때, 빛을 염료 솔루션의 노출을 최소화하기 위해주의하십시오. 또한, DMSO는 흡습이며 염료의 NHS 에스테르와 반응하여 크게 커플링 반응 효율을 감소시킬 공기에서 습기를 흡수합니다. -20 ° C에서 호박 나사 뒤덮힌 유리병에 키트에 제공된 DMSO 유지하고, 응축을 방지하기 위해 열기 전에 상온에 약병을 따뜻한 보자. 이 키트와 함께 제공만을 DMSO를 사용하십시오.
- 싸이 - 3 싸이 - 5 염료 중 하나 패킷을 열고 염색 약병에 직접 DMSO의 75μl를 추가합니다.
- 단계 2.18에서 튜브에 DMSO / 염색 솔루션의 5μl를 추가합니다.
- 잘 믹스 1 시간 동안 어둠 속에서 실온에서 튜브를 품어.
- 염료 결합된 cDNA 솔루션 3M의 아세트산 나트륨의 20μl (산도 5.2) 추가합니다.
- cDNA 솔루션에 버퍼를로드 중 500μl를 추가합니다. vortexing하여 잘 섞는다.
- 명확한 회수 관에 스냅 열 플레이스와 cDNA / 버퍼 솔루션을로드합니다.
- 1 분 상온에서 1만4천그램에서 스핀하며 흐름을 통해 폐기하십시오.
- 같은 컬렉션에서 스냅 열 플레이스튜브, 열 워시 버퍼의 500μl를 추가합니다.
- 1 분 상온에서 1만4천그램에서 스핀하며 흐름을 통해 폐기하십시오.
- 반복 3 단계를 반복합니다. 8-3.9 세 세 500μl 세척의 총 시간.
- 1 분 상온에서 1만4천그램에서 한 번 더 돌려, 흐름을 통해 폐기하십시오.
- 새로운 황색 수집 관에 스냅 열 놓으십시오.
- 1 분 상온에서 SNAP 칼럼과 부화 따뜻한 DEPC - 물 (50 ° C)의 65μl를 추가합니다.
- 1 분 상온에서 1만4천그램에서 스핀과 흐름을 통해 수집합니다. 흐름을 통해 귀하의 cDNA 염료 결합 정화의 60μl 포함해야합니다.
파트 4 : 라벨 절차를 평가.
- 각 싸이 - cDNA 라벨을 평가하기위한 분광 광도계 분석을 실시. 합성 cDNA의 pmol의 총 수를 계산 : [OD 260 X하셨습니다. X 37ng/μl X 10 3 NG / PG] / 324.5 PG / pmol. 각 라벨 반응에 대한 통합 싸이 염색의 총 pmol을 계산 : pmol Cy3 = [OD 550 X하셨습니다.] / 0.15; pmol Cy5 = [OD 650 X하셨습니다.] / 0.25. 다음 각 반응에 대한 pmol / 염기 색소 비율 pmol을 계산합니다. 최적의 반응의> 6000pmol을 생성하는 cDNA (사람마다 60ul)> 싸이 염색의 200pmol (60ul 당), 그리고 <30 뉴클레오 티드 / 염료 비율.
파트 5 : 슬라이드 사전 와시
- PtGen2 배열 코닝 UltraGaps 슬라이드 (아미노 실란 코팅)에 인쇄 cDNAs는 UV - 상호 연결되어 있습니다됩니다. 인쇄 명소 인해 버퍼의 높은 소금 콘텐츠를 명확하게 볼 수 있습니다.
- 인쇄 영역 (옵션)의 상위 및 하위 영역에 대한 슬라이드를 표시하는 다이아몬드 팁 펜을 사용합니다.
- 넣어 약 250mL 43 미리 예열 ° 현미경 슬라이드 세척 접시 (3 "X 4")에 C 0.2 % SDS 솔루션입니다.
- 플레이스 슬라이드는 슬라이드에있는 염분을 제거하는 15-20 번 매우 적극적으로 SDS 솔루션에 슬라이드 랙 및 다이빙에 미리 hybridized 수 있습니다.
- 포셉를 사용하면, 조심스럽게 랙에서 슬라이드를 제거하고 43 ° C. 미리 예열되어 사전 하이브 리다이 제이션 버퍼 (5 배 SSC, 0.1 % SDS, 1 % BSA)이 포함된 코플린있는 항아리에 넣어 적어도 한 시간 동안 43 ° C에서 알을 품다.
6 부 : 사전 하이브 리다이 제이션
- 오 슬라이드 세척 요리 millipure DH 2 O 가득 각과 분자 학년 이소프로판올 가득 한 코플린 병을 설정합니다. 슬라이드 랙에 슬라이드를 삽입하고 20 회 각각 그런 일은하여 다섯 접시를 통해 순차적으로 처리합니다.
- 제거 슬라이드 microfuge (Chipmate의 benchtop, 2 순위)로 슬라이드에 즉시 이소프로판올과 장소에서 다섯 번째 물 세척 및 물놀이 5-6 시간에서 한 번에 두 슬라이드 건조에 1 분 돌린다.
- 압축 공기와 깨끗한 슬라이드 0.22 μm의 필터 카트리지를 통해 필터와 게놈 하이브 리다이 제이션 솔루션 회의소에 직면하고있는 바 코드를 넣으십시오.
- 클린 LifterSlips ™ 필터링 공기와 아래로 직면하고있는 흰색 스트립과 함께 슬라이드에 위치를 함께. 부드럽게 슬라이드 리프터 용지를 정렬하기 위해 노란색 pipet 팁을 사용 (70 % 에탄올에서 ™ 첫번째 LifterSlips 워싱하는 것은 선택 사항입니다. 우리는 그것이 불필요한 것으로 나타났습니다.)
7 부 : 하이브 리다이 제이션
어두운 또는 낮은 조명에서 수행되어야합니다.
- hybridized로 각 슬라이드 들어, 싸이 - 5의 양을 계산하고 싸이 - 3 각 대상의 50 75pmol를 제공하기 위해 cDNA 표시. 37-45에서 하나의 튜브로 그 금액을 결합하여 열 설정을 진공 건조기에서 건조 ° C. 완전히 건조하지 마십시오!
- 말린 60mL 하이브 리다이 제이션 버퍼에 프로브 (그날 만든 신선한)와 소용돌이를 간단히 Resuspend.
- 30 초 동안 95 ° C 목욕 후 빠른 microfuge 5 분 동안 resuspended cDNAs을 품어.
- 천천히 슬라이드의 하단에있는 슬라이드 LifterSlip ™ 접합 (바코드 엔드)에서 pipetting하여 전체 resuspended 프로브 볼륨을로드합니다. 슬라이드 모세의 행동 방식에 의해로드됩니다. (일부는 슬라이드에 피펫 후 부드럽게 LifterSlip을 오버레이 ™ 이것이 거품을 경우 번짐 유물을 현장으로 이어질 수있는 배치 후 LifterSlip ™를 이동할 수 없기 때문에 한 번에 그칠 방법이다하는 것을 선호)
- 각각의 습도에 100mM DTT의 장소 20uL 잘 챔버의 끝에 위치하고 있습니다.
- 챔버에서 최고를 놓고 캠 나사를 조입니다. 50-60 RPM에서 부드러운 교반과 12~18시간에 대한 48 ° C의 물을 욕조에 알루미늄 호일과 담가와 챔버 커버.
8 부 : 포스트 하이브 리다이 제이션 씻는다
모든 세척은 어두운 또는 낮은 조명에서 수행되어야합니다. 슬라이드는 최종 단계까지 건조 허용해서는 안됩니다.
- 1) W : 씻으 솔루션 # 1 @ 53 다음 중 각 250mL 가득 ° C, 4 슬라이드 세척 접시 가득 한 코플린 병을 설정애쉬 솔루션 # 1 @ 53 ° C, 2) 와시 솔루션 # 2 @ 상온, 3 & 4) 와시 솔루션 # 3 @ 실내 온도 담긴 두개의 요리.
- 조심스럽게 하이브 리다이 제이션 실에서 슬라이드를 제거하고 코플린 용기에 한 번에 두 장소. 30 초 남겨 후 천천히 슬라이드를 채취해서 리프터 신청서는 병 속에 남아있게됩니다. 플레이스 슬라이드 랙 및 씻으 솔루션 # 1 (1X SSC, 0.2 % SDS, 앞서 열을 가하다 43 ° C)에 즉시 담가에 슬라이드. 모든 LifterSlips 제거하고 세탁하는 모든 슬라이드가 씻으 솔루션 # 1 접시에 때까지 반복합니다. 노골적인 협상을 10 번 랙를 플런지 아래.
- 53 플레이스 요리 ° 10 분 50-100 rpm으로 잡고 공기 통에 C.
- 상온에서 해결책 # 2 (0.1X SSC, 0.2 % SDS), 플런지 10 배, 그리고 부화를 씻어 랙을 전송, 10 분 동안 흔들어 천천히.
- 딥 랙은 첫 번째 씻으 솔루션 # 3 (0.1X SSC)에 15 배는 잔여 SDS는 씻어 솔루션 # 2에서 이월 제거합니다. 두 번째 와시 솔루션의 장소 랙은 # 3 요리, 플런지 10 배, 그리고 10 분 동안 흔들어 천천히.
- 원심 분리기에 50mL 팰컨 뒤덮힌 튜브와 스핀 @ 1,500 RPM에서 플레이스 슬라이드 스윙 버킷 로터가 장착되어. 침대 용기를 조명하기 위해 슬라이드를 제거, 우리는 (오존 수준이 높은 경우 이것은 여름에 특히 싸이의 염료, 싸이 - 5의 산화를 감소 단단히 다른 알루미늄 호일로 덮여 팔콘 튜브, 그리고 질소 가스와 함께 튜브에서 퍼지 공기 캡을 사용하여 ). 슬라이드 전에 질소 정화 튜브에 검색하기 위해 몇 시간 동안 저장할 수 있습니다, 스캐닝이 즉시 세척 후 완료되면 그러나, 최상의 신호 결과를 얻을 수있다.
파트 9 : 데이터 수집 및 통계 분석
- 스캔 이미지 데이터는 PerkinElmer의 ScanArray에 수집됩니다. 우리는 10 미크론 스캔 설정 및 균형 Cy3와 제조 업체의 지침에 따라 같은 라인 조정 방법을 사용하여 Cy5 신호를 사용합니다.
- TIF 파일은 gridded하고 원시 신호 데이터 ImaGene 버전 7.5 (BioDiscovery (주), 엘 세군도, CA)를 수집 및 여과
- 데이터 정규화 및 통계 유효 differentially 표현 수종을 결정하기 위해 평가 BRB 배열 도구 버전과 함께 이루어집니다. 3.7.
- coordinately 표현 유전자 결정을 촉진하기위한 패턴 분석 유전자 발현 패턴 분석 소프트웨어 (GEPAS) 버전과 함께 이루어집니다. 3.1.
그림 1.이 protoco 난을 사용하여 처리 PtGen2 배열의 예
그림 2. 표준 하이브 리다이 제이션 및 세탁 프로토콜을 사용하여 처리 PtGen2 배열의 예.
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Discussion
PtGen2는 로블롤리 파인 연구 커뮤니티 주로 사용되도록 설계되었고 최근 개발, 사용자 정의 cDNA microarray입니다. 생성된 예비 결과는 지금까지 transcriptional 가뭄 스트레스에 대한 응답으로 발생하는 이벤트뿐만 아니라 해양 소나무, 피너스 피나 우리가 5,6의 배아 발달 동안 발생하는 모니터링 기능 변경 사항으로의 평가에 유용한 도구가 될 수있는 배열을 보였습니다 또한 최근 5 PtGen2와 같은 피너스 및 기타 침엽수 종의 유전자 발현을 연구 연구자에 의해 이용되고 잘 코니퍼 장군의 다양한 격리 대상 샘플을 사용하여 교차 종의 hybridizations에 PtGen2 작품.이 훈련 동영상 필요한 그들을 제공해야한다는 증명 기술 재단은 품질과 재현성 데이터를 생성합니다. 일반적으로 microarray 작업에 사용된 것보다 더 엄격한 하이브 리다이 제이션 및 세탁 프로토콜을 처리하면 우리 손에, PtGen2 더 나은 결과를 굴복. PtGen2 배열을 처리하는 다른 방법은 성공했지만 일관성이 부족합니다. 여기에서 설명한 기술 단계를 수행하면 배열의 큰 숫자를 처리 특히, 일관성을 높이기 위해 도움이 될 것입니다, 또한 크게 원치 않는 아티팩트 높은 배경을 감소 및 제거하는 데 도움이 될 것입니다.
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Acknowledgments
라벨, 하이브리드화, 그리고 세척 프로토콜은 여기에 몇 가지 게놈 연구 (TIGR), 밴더빌트 Microarray 공유 리소스 (VMSR)에서 박사 숀 레비의 연구소에서 동시에 박사 J. 쿼큰부쉬에 의해 이전에 개발된들에게 수정하고, 박사를 포함 롭 알바 보이스 톰슨 연구소 (BTI) 코넬 대학교에서있는 동안.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Pre-hybridization Buffer | Buffer | 5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA | ||
| Hybridization Buffer | Buffer | 30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS | ||
| Wash Solution #1 | Buffer | 1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C | ||
| Wash Solution #2 | Buffer | 0.1X SSC, 0.2% SDS | ||
| Wash Solution #3 | Buffer | 0.1X SSC | ||
| Isopropyl Alcohol | Reagent | Sigma-Aldrich | 34959-2.5L | |
| 50mL Conical Tubes | Other | Falcon BD | 352070 | |
| 15mL Conical Tubes | Other | Falcon BD | 352196 | Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation |
| Coplin Jar | Wheaton | 900520 | ||
| Staining Dish & Rack | Other | Wheaton | 900200 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Other | Sigma-Aldrich | A-9418 | |
| PolyA RNA | Invitrogen | POLYA.GF | ||
| SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling | Kit | Invitrogen | L1014-02 | |
| Turbo DNase | Kit | Ambion | AM1907 | |
| System | ||||
| Cy-5 Dye | Reagent | GE Healthcare | PA25001 | |
| Cy-3 Dye | Reagent | GE Healthcare | PA23001 | |
| LifterSlips™ | Other | Erie Scientific | 25X601 | |
| HybChambers | Equipment | GeneMachines | JHYB200003 |
References
- Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
- Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. unpublished data. , Forthcoming.
- Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques. 29, 548-562 (2000).
- Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development. The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).
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- Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. September 24-27, Albena, Bulgaria, , (2008).
