Summary
КДНК микрочипов PtGen2 был разработан для изучения экспрессии генов в ладанной сосна,
Abstract
PtGen2 это 26496 особенность кДНК микрочипов содержащие усиливается ЭБТ ладанной сосны. Массива производится в нашей лаборатории для исследователей изучения экспрессии генов в сосны и других хвойных пород. PtGen2 была разработана как результат наших генов открытие усилия в ладанной сосна, и состоит из последовательности определены в основном из ткани корней, но и от иглы и стебля. 1,2 PtGen2 была проверена путем гибридизации различных Су-красителя помечены кДНК хвойных целевой , используя как усиливается и без усилителей косвенных методов маркировки, а также протестированы с числом гибридизации и стиральные условиях. Это видео фокусируется на обработке и переработке слайды до и после предварительной гибридизации, а также после гибридизации, используя некоторые изменения в процедуры, разработанные ранее. 3,4 Также, в текстовом виде только в протоколах, используемых для производства, маркировки и очистки целевых кДНК с, а также информацию о программном обеспечении, используемом для последующей обработки данных.
PtGen2 печатается с собственной буфера печати, содержит высокую концентрацию солей, которые могут быть трудно удалить полностью. Слайды промывают сначала в теплом растворе SDS до предварительно гибридизации. После предварительного гибридизации, слайды моют энергично в нескольких сменах воды до полного удаления оставшихся солей. LifterSlips ™ затем очищается и устанавливается на слайды и помечены кДНК тщательно загружены на микрочипов путем капиллярного действия, который предусматривает равномерное распределение по всей образец слайдов, а также снижает шансы пузырь регистрации. Гибридизация целей для массива осуществляется на 48 ° C в условиях повышенной влажности. После гибридизации серии стандартных моет выполняются на 53 ° C и комнатной температуре в течение длительного времени. Обработка PtGen2 слайды с помощью этой техники уменьшает соль и SDS-производные артефакты часто видел, когда массив обрабатывается менее строго. Гибридизации цели основе нескольких различных хвойных источников РНК, эта обработка протокола дали меньше артефактов, снижение фона, и обеспечивает более полный согласованности между различными экспериментальными группами массивов.
Protocol
(Обратите внимание, Разделы 1 - 4 не продемонстрировали в видео)
Подготовка Су-Маркированный целевых кДНК
Далее следует протокола мы используем для синтеза кДНК из ладанной сосна общей РНК и косвенных кДНК маркировки до микрочипов гибридизации. Хотя некоторые нетривиальные изменения были сделаны, протокол Ниже же, как в инструкции обеспечены Надстрочный Косвенные Invitrogen в кДНК Kit маркировки.
Часть 1: Первая цепь кДНК реакции синтеза
- Смешать и кратко спина каждый комплект компонентов перед использованием.
- Подготовка реакции следующим образом:
- Xμl DEPC-H 2 O
- Xμl общей РНК, 20 мкг / реакции (предварительно обработанных Turbo ДНКазы Амбион в)
- 2μl Закрепленные олиго (дТ) 20 Primer (2.5μg/μl)
- Случайные 1 мкл праймера гексамера
- Общий объем = 18μl
- Инкубировать пробирки при 70 ° C в течение 5 минут, а затем поместить на льду в течение 1-2 минут.
- Добавьте в каждую реакционную трубку на льду:
- 6μl 5X первого Strand буфер
- 1.5μl 0,1 М ДТТ
- 1.5μl 10mM дНТФ смеси
- 1 мкл RNaseOUT (40U/μl)
- 2μl Надстрочный III RT (400U/μl)
- Осторожно перемешать и спин кратко. Выдержите трубки в течение ночи при 45 ° C.
- Добавить 15μl 1М NaOH для каждой реакции трубки и тщательно перемешать.
- Выдержите трубки при температуре 70 ° С в течение 10 минут.
- Добавить 15μl 1М HCl, аккуратно перемешать.
- Добавить 20 мкл 3М ацетата натрия (рН 5,2), аккуратно перемешать.
Часть 2: Очищающий первой цепи кДНК.
- Добавить 500 мкл погрузки Буфер кДНК (со стадии 1,9) и хорошо перемешать.
- Место Колонка SNAP очистки (поставляется вместе с комплектом Косвенные маркировки) на пробирку и загружать кДНК на колонне.
- Спиновые при 14000 г при комнатной температуре в течение 1 минуты; отказаться проточные.
- Место SNAP Колонка на ту же трубку коллекции и добавить 500 мкл промывочного буфера.
- Спиновые при 14000 г при комнатной температуре в течение 1 минуты; отказаться проточные.
- Повторите шаги 2,4 и 2,5 в три раза, в общей сложности три 500 мкл стирок.
- Спиновые еще один раз на 14 000 г при комнатной температуре в течение 1 минуты с; отказаться проточные.
- Место SNAP колонки на новые 1,5 мл трубки.
- Добавить 50 мкл теплой DEPC воде (50 ° С) до Колонка SNAP и инкубировать колонки при комнатной температуре в течение 1 минуты. Элюировать кДНК через спину при 14000 г при комнатной температуре в течение 1 минуты.
- Повторите шаг 2,9, используя 100 мкл теплой DEPC воды и 1,5 мл же трубка для элюента.
- Добавить 20 мкл 3М ацетата натрия (рН 5,2), чтобы элюента от шагов, 2.9 и 2.10.
- Добавить 3μl гликогена (20mg/ml) к трубке и перемешать.
- Добавить 500 мкл ледяной 100% этаноле, хорошо перемешать и инкубировать трубки в течение 1 часа при температуре -80 ° C.
- Спиновые трубки при 14000 г при 4 ° С в течение 20 минут. Осторожно удалите супернатант.
- Добавить 500 мкл ледяной 70% этанола и спин трубки при 14000 г при 4 ° С в течение 5 минут. Осторожно удалите супернатант.
- Воздух сухой образец в течение 5 минут, чтобы все этанола удаляется.
- Теплый 2X буфера муфты при 37 ° С в течение 5 минут и повторно приостанавливать кДНК 5 мкл образца в теплых 2X буфера связью.
- Тепло кДНК / муфты буфера при 50 ° С в течение 10 минут и вихрем хорошо. Убедитесь, что ваш шарик кДНК полностью ресуспендировали в 2х буфера связью.
Часть 3: Маркировка с флуоресцентным красителем
При подготовке реакции, будьте осторожны, чтобы минимизировать воздействие раствора красителя на свет. Кроме того, ДМСО гигроскопичны и поглощают влагу из воздуха, который вступает в реакцию с эфиром НГС красителя и значительно уменьшить реакцию сочетания эффективности. Держите ДМСО поставляется в комплекте в винтовой крышки флакона янтаря при температуре -20 ° С, а флакон нагреться до комнатной температуры перед открытием, чтобы предотвратить конденсацию. Используйте только ДМСО, поставляемый с этим комплектом.
- Откройте один пакет Су-3 или Су-5 на основе красителя и добавить 75μl ДМСО непосредственно краситель флаконе.
- Добавить 5 мкл раствора ДМСО / красителя к трубке с шага 2.18.
- Хорошо перемешать и инкубировать трубки при комнатной температуре в темном месте в течение 1 часа.
- Добавить 20 мкл 3М ацетата натрия (рН 5,2), чтобы краска связью кДНК решение.
- Добавить 500 мкл погрузки Буфер кДНК решение. Хорошо перемешайте на вортексе.
- Место SNAP Колонка на барабане из прозрачного сбора и нагрузки кДНК / буферного раствора.
- Спиновые при 14000 г при комнатной температуре в течение 1 минуты; отказаться проточные.
- Место SNAP столбец той же коллекциитрубки, добавить 500 мкл промывочного буфера в колонку.
- Спиновые при 14000 г при комнатной температуре в течение 1 минуты; отказаться проточные.
- Повторите шаги 3. 8-3.9 три раза, в общей сложности три 500 мкл стирок.
- Спиновые еще один раз на 14 000 г при комнатной температуре в течение 1 минуты; отказаться проточные.
- Место SNAP колонки на новые трубки коллекция янтаря.
- Добавить 65μl теплого DEPC воде (50 ° С) до Колонка SNAP и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 минуты.
- Спиновые при 14000 г при комнатной температуре в течение 1 минуты и собирать проточные. Проточный должна содержать 60μl вашей очищенной красителя связью кДНК.
Часть 4: Оценка Маркировка процедуры.
- Поведение спектрофотометр анализа для оценки каждого Су-кДНК маркировки. Рассчитать общее количество пмоль синтезированных кДНК: [OD 260 х вып. 37ng/μl х х 10 3 нг / пг] / 324,5 пг / пмоль. Рассчитать общую пмоль включены Су-Dye для каждого маркировки реакции: пмоль Cy3 = [OD 550 X том] / 0,15; пмоль Cy5 = [OD 650 X том] / 0,25. Затем вычислить пмоль нуклеотидных / пмоль красителя соотношение для каждой реакции. Оптимальная реакция генерировать> 6000pmol кДНК (на 60ul),> 200pmol Су-краска (в 60ul) и нуклеотидных / красителя коэффициент, который составляет <30.
Часть 5: Слайд Предварительная стирка
- PtGen2 массива напечатан на Corning слайды UltraGaps (амино-силана с покрытием) и кДНК являются УФ-накрест связаны между собой. Печать пятна хорошо видны из-за высокого содержания соли буфера.
- Используйте перо алмаза наконечник, чтобы отметить слайд для верхних и нижних областях область печати (опция).
- Положите примерно 250 мл подогретого до 43 ° C 0,2% SDS раствора в стекло микроскопа мыть блюда (3 "х 4").
- Место слайды, которые будут предварительно гибридизированных в стойке слайд-шоу и окунуться в решение SDS 15-20 раз очень энергично, чтобы удалить соли на слайдах.
- Использование щипцов, тщательно удалить слайды из стойки и поместите их в банку Коплин содержащие Предварительно гибридизации буфер (5X SSC, 0,1% SDS, 1% BSA), которая была предварительно нагревают до 43 ° C. Инкубировать при 43 ° С в течение не менее одного часа.
Часть 6: Pre-Гибридизация
- Настройка пять слайд мытья посуды, заполненными millipure дН 2 O, и один Коплин банки заполнены молекулярным класса изопропанола. Место слайдов в слайд стойки и процесс последовательно через пять блюд на Данкинг 20 раз каждый.
- Удалить слайды два одновременно с пятого промывочной воды и погрузите в 5-6 раз в изопропанола и сразу же место в слайды в слайд микроцентрифужную (Chipmate настольный, 2 позиции) и спином 1 минуты, чтобы высохнуть.
- Чистая слайды с помощью сжатого воздуха фильтруют через 0,22 мкм фильтр картридж и разместить их с штрих-кодом вверх в геномной гибридизации палаты Solutions.
- Чистая LifterSlips ™ с фильтром воздуха и поместите их на слайды с белыми полосами вниз. Используйте желтый наконечник пипетки, чтобы аккуратно выровнять ручка скольжения на слайде (стиральная LifterSlips ™ первым в 70% этанола не является обязательным. Мы обнаружили, что она не нужна.)
Часть 7: Гибридизация
Должно быть проведено в темноте или условиях низкой освещенности.
- Для каждого слайда можно гибридизированных, рассчитать количество Су-5 и Су-3 помечены кДНК, чтобы дать 50-75pmol каждой цели. Комбинат этих сумм в единую трубу и сухое в вакуум-эксикаторе с термостабилизации при 37-45 ° С. Избегайте сушки полностью!
- Ресуспендируют сушеные зондов в 60 мл буфера гибридизации (из свежих этот день) и вихревые кратко.
- Инкубируйте ресуспендировали кДНК течение 5 минут в 95 ° C ванне, а затем быстро микроцентрифужную течение 30 секунд.
- Нагрузка весь объем ресуспендировали пробного медленно пипетки на слайд-LifterSlip ™ перехода на дно (в конце штрих-кода) в слайд. Слайд будет загружать путем капиллярного действия. (Некоторые предпочитают пипетки на слайд, а затем аккуратно наложения LifterSlip ™ это один выстрел метод, так как если вы получаете пузырьки вы не можете двигаться LifterSlip ™ после размещения, которая может привести к размытию месте артефакты)
- Место 20 мкл 100 мм DTT в каждую влажность хорошо, расположенных на концах камеры.
- Место сверху на камеру и затянуть винты камеры. Крышка камеры с алюминиевой фольгой и погрузиться в 48 ° C водяной бане в течение 12-18 часов с нежным агитации на 50-60 оборотов в минуту.
Часть 8: Пост-гибридизация Моет
Все моет должны проводиться в темноте или условиях низкой освещенности. Слайды никогда не должно быть позволено сухое пока последний шаг.
- Настройка один Коплин банки заполнены промывочного раствора № 1 @ 53 ° C, а также четыре слайда мытья посуды заполненный 250 мл каждого из следующих действий: 1) Wзолы Решение № 1 @ 53 ° C, 2) промывочного раствора № 2 @ комнатной температуры, 3 и 4) две блюд, содержащих промывочного раствора № 3 @ комнатной температуре.
- Осторожно удалите слайды из гибридизации камеры и разместить их по два за раз в банку Коплин. Оставьте на 30 секунд, затем поднимите слайд медленно и скольжения ручка останется в банке. Место слайдов в слайд стойку и немедленно погрузиться в промывочного раствора № 1 (1X SSC, 0,2% SDS, подогреть до 43 ° С). Повторяйте, пока все LifterSlips удаляются и все слайды для стирки, должны быть в промывочного раствора № 1 блюдо. Окунитесь стойке вверх-вниз 10 раз энергично.
- Место блюдо в 53 ° С на воздухе шейкере при встряхивании на 50-100 оборотов в минуту в течение 10 минут.
- Передача стойку, чтобы промывочного раствора № 2 (0.1X SSC, 0,2% SDS), окунуться в 10 раз, и инкубировать при комнатной температуре, медленно покачивая в течение 10 минут.
- Опустите стойку 15 раз в первый промывочного раствора № 3 (0.1X SSC), чтобы удалить остатки SDS переносятся с промывочного раствора № 2. Место стойку во второй промывочного раствора № 3 блюда, окунуться в 10 раз, а затем медленное встряхивания в течение 10 минут.
- Место слайдов в 50 мл Сокол ограничен трубками и спина @ 1500 оборотов в минуту в центрифуге оснащен ротором размахивая ведром. Удалить слайды на свет оборудована устройством, контейнер, мы используем другой трубке Сокол покрыта алюминиевой фольгой, и очищать воздух из трубки азотом, крышка плотно (это уменьшает окисление Су красители, особенно Су-5 в летнее время, когда уровни озона являются самыми высокими ). Слайды могут храниться в течение нескольких часов перед сканированием в азоте очищены труб, однако, наилучшие результаты получаются сигнала при сканировании производится сразу же после мытья.
Часть 9: сбор данных и статистический анализ
- Данные сканирования изображений собраны на ScanArray PerkinElmer. Мы используем 10 микрон настройки сканирования и баланс Cy3 и Cy5 сигналов с использованием метода линейного корректировка в соответствии с инструкциями производителя.
- TIF файлы сетке и данные сигнала собирается и фильтруется с ImaGene Версия 7.5 (BioDiscovery, Inc, Эль Сегундо, Калифорния)
- Данные нормализации и оценку, чтобы определить статистически достоверные разному экспрессируются видов осуществляется с BRB массива инструменты Ver. 3.7.
- План анализа для облегчения определения координационно выразил генов осуществляется с помощью генной экспрессии программное обеспечение для анализа (GEPAS) Ver. 3.1.
Рисунок 1. Пример PtGen2 массив обрабатывается с помощью этой protoco л
Рисунок 2. Пример PtGen2 массив обрабатывается с использованием стандартной гибридизации и стиральные протоколов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PtGen2 является недавно разработанный, пользовательские кДНК микрочипов, который был предназначен для использования прежде всего научного сообщества сосны ладанной. Предварительные результаты, полученные к настоящему времени показали, массив будет ценным инструментом в оценке транскрипционных событий, которые происходят в ответ на засухи, а также в мониторинге изменений, которые происходят во время развития эмбриона в приморской сосны, Pinus приморская сосна 5,6 У нас есть Кроме того, недавно показали, что PtGen2 хорошо работает в поперечном гибридизации видов с использованием целевых образцов выделенных из самых разных родов хвойных пород. 5 Как PtGen2 становится все более используются исследователей, изучающих экспрессии генов в сосны и других хвойных пород, это обучающее видео должно обеспечить их необходимыми техническую основу для достижения качественных и воспроизводимые данные. В наших руках, PtGen2 дала лучшие результаты при обработке более жесткие гибридизации и стиральные протоколов, отличных от тех, которые обычно заняты на работах микрочипов. Другие подходы к обработке PtGen2 массиве были успешными, но не хватало согласованности. После технические шаги, описанные здесь, будут способствовать повышению согласованности, особенно при обработке большого числа массивов, а также поможет значительно сократить и ликвидировать нежелательные артефакты и высокий фон.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Маркировки, гибридизации, и стиральная протоколов, содержат некоторые изменения, разработанные ранее д-ром Дж. Квакенбуш в то время как института геномных исследований (ТИГР), доктор Шон Леви в Вандербильта Microarray общему ресурсу (VMSR), и д-р Роб Альба в то Бойс Томпсон институт (БТИ) Корнельского университета.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Pre-hybridization Buffer | Buffer | 5X SSC, 0.1% SDS, 1% BSA | ||
| Hybridization Buffer | Buffer | 30% formamide, 5X SSC, 5X Denhardt’s, 1% PolyA RNA (Invitrogen, POLYA.GF), 0.1% SDS | ||
| Wash Solution #1 | Buffer | 1X SSC, 0.2% SDS, preheat to 43°C | ||
| Wash Solution #2 | Buffer | 0.1X SSC, 0.2% SDS | ||
| Wash Solution #3 | Buffer | 0.1X SSC | ||
| Isopropyl Alcohol | Reagent | Sigma-Aldrich | 34959-2.5L | |
| 50mL Conical Tubes | Other | Falcon BD | 352070 | |
| 15mL Conical Tubes | Other | Falcon BD | 352196 | Use this or a similar cap placed at the bottom of each 50mL conical tube during centrifugation |
| Coplin Jar | Wheaton | 900520 | ||
| Staining Dish & Rack | Other | Wheaton | 900200 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Other | Sigma-Aldrich | A-9418 | |
| PolyA RNA | Invitrogen | POLYA.GF | ||
| SuperScriptTM Indirect cDNA Labeling | Kit | Invitrogen | L1014-02 | |
| Turbo DNase | Kit | Ambion | AM1907 | |
| System | ||||
| Cy-5 Dye | Reagent | GE Healthcare | PA25001 | |
| Cy-3 Dye | Reagent | GE Healthcare | PA23001 | |
| LifterSlips™ | Other | Erie Scientific | 25X601 | |
| HybChambers | Equipment | GeneMachines | JHYB200003 |
References
- Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries. Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).
- Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. unpublished data. , Forthcoming.
- Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. A concise guide to cDNA microarray analysis. Biotechniques. 29, 548-562 (2000).
- Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development. The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).
- Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray. IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. August 25-29, Quebec City, Quebec, , (2008).
- Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. September 24-27, Albena, Bulgaria, , (2008).
