ES-Zellen abgeleiteten neuroepithelialen Zellkulturen

Summary

Ableitung von neuro-Vorläufer aus embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) mit Stroma-Zellen abgeleiteten induzierende Aktivität (SDIA).

Abstract

ES-Zellen haben das Potenzial, in die Zellen aus aller Keimblätter, die sie zu einem attraktiven Werkzeug für die Entwicklung neuer Therapien ist zu differenzieren. In der Regel folgt die Differenzierung von ES-Zellen das Konzept zum ersten generieren unreifen Vorläuferzellen, die dann vermehrt und differenziert zu reifen zellulären Phänotypen können. Dies gilt auch für ES-Zellen abgeleiteten Neurogenese, in denen die Entwicklung von neuralen Zellen folgt zwei wichtige Schritte: Erstens, die Gewinnung und Erweiterung von unreifen Vorstufen neuroepithelial und zweitens, deren Differenzierung zu reifen Nervenzellen. Eine gängige Methode, um neuronale Vorläuferzellen aus ES-Zellen produzieren auf Embryoidkörper (EB)-Bildung, die die Differenzierung von Zellen aus aller Keimblätter einschließlich Neuroektoderms verrät basiert. Eine alternative und effizientere Methode, um neuro-Zell-Entwicklung zu induzieren verwendet Stroma-Zellen abgeleiteten induzierende Aktivität (SDIA), die durch Co-Kultivierung ES-Zellen mit Totenkopf aus Knochenmark stammende Stromazellen (1) erreicht werden kann. Beide, EB Bildung und SDIA zeigen die Entwicklung der Rosette-ähnliche Strukturen, die vermutlich neuronale ähneln Rohr-und / oder Neuralleiste-like Vorfahren. Die neuralen Vorläuferzellen isoliert werden ausgebaut und weiter differenziert in bestimmten Neuronen und Gliazellen mit definierten Kulturbedingungen. Hier beschreiben wir die Erzeugung und Isolierung solcher Rosetten in Co-Kultur Experimente mit der stromalen Zelllinie MS5 (2-5).

Protocol

Schritt 1

1. Platte Mitomycin-C ggrowth-gehemmt (10 ug / ml für 2,5 Stunden) MS5 Zellen mit einer Dichte von 70.000 / cm2 auf Gelatine-beschichteten (0,01% für 30 Minuten) 6-Well-Platten in α-MEM-Medien.
2. Wenn die Zellen verbunden sind und bildeten eine Monoschicht (über Nacht Wachstum), wechseln Sie in SRM.
3. Manuell zu isolieren ES Zellkolonien aus der ES-Zellkulturen mit Hilfe einer Spritze mit einer 27 ½ G Nadel.
4. Tritrurate den Kolonien vorsichtig mit einem 1 ml blaue Spitze und Platte bei geringer Dichte auf der MS5 Zellen (in der Regel 2-3 Kolonien pro 6-Well-Platte).

Hinweis: Die ES-Zellen können auch aus der enzymatischen Vermehrung mittels Collagenase oder Trypsin genommen werden.

Schritt 2

1. Wachsen die ES-Zellen auf der MS5 Feeder für 14-21 Tage, bis Rosette-haltigen Kolonien zu bilden.

Hinweis: Ändern Medien oft. Die Rosetten sind in der Regel an den äußeren Rändern der Kolonien und ihre Bildung deutlich verbessert werden kann, wenn 300-500 ng / ml Noggin dem SRM (3) hinzugefügt wird. In einigen Differenzierung Protokollen kann SRM mit N2-A Media ausgetauscht und ergänzt werden mit dem Wachstum oder andere Faktoren zu Zelle Spezifikation (2-5) zu fördern.

Schritt 3

1. Isolieren und wählen Sie die Rosetten mit einem 27 ½ G Nadel unter dem Mikroskop.

Hinweis: Vermeiden Sie Schnitte und Kommissionierung der MS5 Stromazellen. Wenn Kolonien mit Rosetten sind gepackt, kann man auch die Isolierung der gesamten Kolonie.

Schritt 4

1. Saugen Sie das Cluster von Rosetten, tritrurate sie sorgfältig mit einer 1 ml blaue Spitze und Platte sie auf Poly-L-Ornithin (0,001%) und Fibronektin (1 pg / ml) oder Laminin (1 pg / ml)-beschichteten 6 Vertiefungen in N2-A Media in der Regel mit bFGF (20 ng / ml) ergänzt. Die Rosetten wird die Reform und Erweiterung.

Hinweis: Um das Überleben der Zelle zu verbessern, kann eine Platte der kleinen Clustern in Tröpfchen zu erhöhen Zelldichte. Dieser Schritt kann auch durch Ergänzung der N2-A-Medien mit zusätzlichem Wachstum oder andere Faktoren zu Zelle Spezifikation (2-5) zu fördern geändert werden.

Discussion

Dieses Protokoll zeigt die verschiedenen Schritte bei der Erzeugung und Isolierung Neuroepithelzellen aus menschlichen ES-Zellen mit SDIA. Die Anwendung dieser Methode ist vielfältig und hat in vielen Protokollen verwendet worden, um bestimmten Nervenzellen zu produzieren (z. B. 1, 2, 5-9). Die Rosetten sind gedacht, um Neuralrohrdefekte Zellen mit einer vorderen Phänotyp (2, 5, 10) ähnlich und enthalten auch Neuralleiste Vorläuferzellen (11, 12). Darüber hinaus behalten sie ein gewisses Maß an Plastizität, da sie durch spezifische Faktoren in definierten Kulturbedingungen gemusterten werden kann. So kann die SDIA-derived neuralen Vorläuferzellen zu zahlreichen Zelltypen aus dem zentralen und peripheren Nervensystems so dass sie ein nützliches Werkzeug für die Ableitung von verschiedenen neuronalen Zellpopulationen in ES-Zell-Differenzierung Paradigmen.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
L-Glutamine		GIBCO, by Life Technologies	25030
alpha-MEM		GIBCO, by Life Technologies	12571
Penicillin/streptomycin		GIBCO, by Life Technologies	15140
Knockout-DMEM		GIBCO, by Life Technologies	10829
Knockout serum replacement		GIBCO, by Life Technologies	10828
MEM nonessential amino acid solution		GIBCO, by Life Technologies	12383
DMEM/F12		GIBCO, by Life Technologies	11330
N2-A supplement		Stem Cell Technologies	07152
Mitomycin-C		Sigma-Aldrich	M0503
Gelatine type-A		Sigma-Aldrich	G1890
poly-L-ornithine		Sigma-Aldrich	P4957	0.01% solution
Laminin		Sigma-Aldrich	L-2020
Fibronectin		Sigma-Aldrich	F2006
Basic fibroblast growth factor (bFGF)		Invitrogen	13256
1 mL Syringe with 27 1/2 G needle		BD Biosciences	309623
N2-A media	medium			DMEM/F12 + 1% N2-A supplement
Serum replacement media (SRM)	medium			Knockout-DMEM + 20% Knockout serum replacement +1% MEM nonessential amino acid solution + 2 mM L-glutamine
α-MEM media	medium			α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% penicillin/streptomycin
MS5	cell line			stromal cells
Microscope
6-well Plates				for tissue culture