Summary
De MTT assay is een eenvoudige en reproduceerbare colorimetrische assay voor de evaluatie van de levensvatbaarheid van de cel op basis van vermindering van de geel MTT en de productie van water oplosbare paarse formazan. Hier heeft de levensvatbaarheid van MCF-7 cellen na behandeling van nanogenomedicine geëvalueerd.
Abstract
Cytotoxiciteit van de futuristische nanogenomedicine (bijvoorbeeld short interfering RNA en antisense) kunnen belemmeren haar klinische ontwikkeling. Van deze kunnen de gen-gebaseerde geneeskunde en / of de drager ervan te lokken cellulaire toxiciteit. Voor de beoordeling van deze cytotoxiciteit, een gemeenschappelijke methodologie is grotendeels afhankelijk van gebruik van de 3 - (4, 5-dimethyl-2-thiazolyl) -2, 5-difenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) test die veelvuldig gebruikt als een colorimetrische aanpak, gebaseerd op de activiteit van de mitochondriale dehydrogenase enzymen in de cellen. In dit huidige onderzoek werden MCF-7 cellen geïnoculeerd in 96-wells plaat en op 50% confluentie ze werden behandeld met verschillende nanopolyplexes en onderworpen aan test na 24 uur MTT. Water oplosbaar geel MTT wordt gemetaboliseerd door het metabool actieve cellen aan het water onoplosbare paarse formazan, die verder wordt opgelost in buffer dimethylsulfoxide en Sornson s pH 10,5. Het resulterende product kan worden gekwantificeerd door spectrofotometrie met behulp van een plaat reader bij 570 nm.
Protocol
MCF-7 zaaien in 96-well plaat:
MCF-7 cellen werden gekweekt in 25 t-kolf in medium dat Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 10% FBS, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine bij 37 ° C met 5% CO 2, 95% lucht en compleet vochtigheid. Eenmaal bereikt, ~ 90% confluentie, werden ze losgemaakt met behulp van 0,05% trypsine / EDTA en geteld door middel van trypan blauw en hemocytometer. Deze cellen werden vervolgens geresuspendeerd bij een concentratie van 4 × 10 4 cellen / cm 2 en toegevoegd op 96-well plaat (dat wil zeggen, 250 ul / putje) door een 8-kanaals pipet. Voor achtergrondinformatie absorptie, werden enkele waterputten bleven cel-vrij, dat wil zeggen als blanco controle.
Het behandelen van cellen met verschillende nanopolyplexes:
Bij 40-50% confluentie (48 uur na zaaien), werden de gekweekte cellen behandeld met nanogestructureerde starburst polyamidoamine dendrimeren (dat wil zeggen, Superfect ® en Polyfect ®) en een nieuwe polymeer-test na de transfectie instructie door de leverancier. Cellen werden ook behandeld met EGFR en scrambled antisense alleen, en met de drie verschillende nanopolyplexes van deze twee oligonucleotiden en met polymeren (n = 4). Vier putjes werden nog niet behandeld als controle. Na 4 uur de behandeling media werden verwijderd en weer aangevuld met verse media.
MTT-test voor het evalueren van levensvatbaarheid van de cellen:
MTT-test werd uitgevoerd 24 uur na transfectie. Voor dit doel werd MTT-oplossing bereid op 1mg/ml in PBS en werd gefilterd door een 0,2 um filter. Daarna werden 50 ul MTT plus 200 ul DMEM zonder fenol rood toegevoegd aan elk putje, met uitzondering van de cel-vrije lege putten. Cellen werden geïncubeerd gedurende 4 uur bij 37 ° C met 5% CO 2, 95% lucht en compleet vochtigheid. Na 4 uur werd het MTT-oplossing verwijderd en vervangen door 200 ul van DMSO en 25μl Sorenson's glycine buffer (0,1 M glycine, NaCl 0,1 M, pH: 10,5 bij 0,1 NaOH). De plaat werd verder geïncubeerd gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, en de optische dichtheid (OD) van de putten werd bepaald met behulp van een plaat lezer op een test golflengte van 570 nm en een referentie golflengte van 630 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De MTT test wordt beschouwd als een veelzijdige methode te zijn en derhalve de levensvatbaarheid van de cellen kunnen worden geëvalueerd op verschillende behandelingen. De productie van de resulterende formazan lijkt te zijn in verhouding tot het niveau van de energiestofwisseling in de cellen. Daarom is het mogelijk om het metabolisch geactiveerde cellen te meten, zelfs in de afwezigheid van celproliferatie. De hoeveelheid formazan geproduceerd is evenredig met de hoeveelheid van MTT in de incubatie-medium. Terwijl de concentratie van de MTT die nodig is om een maximale hoeveelheid formazan bereiken geproduceerd kan veranderen na het gebruik van de verschillende cellijnen. Bovendien hebben gebruikt deze test, kan zeer klein aantal levende cellen worden gedetecteerd en het aantal fouten minimaal zou zijn, omdat er geen noodzaak voor het wassen van stappen. De absorptie van formazan hangt af van het aantal cellen en de pH die kan met toevoeging van buffer worden overwonnen bij pH 10,5: 1. De kleur van formazan is stabiel voor een paar uur bij kamertemperatuur 2. In het geval van meer dan een plaat, moeten controles worden opgenomen in andere platen ook. Toch is deze methode lijdt aan een paar kleine nadelen: a) metabool inactieve cellen kunnen niet worden gediscrimineerd ten dode cellen 3, b) MTT-oplossing dient te worden beschermd tegen licht, hoewel het kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende een periode van maximaal een maand 2, c) zij geen drugs stabiliteit valideren in het medium, en d), cellen die voor MTT kan nadien niet worden gebruikt voor andere testen.
Er dient te worden opgeroepen dat fenol rood absorbeert bij 570 nm. Verder is het al eerder gemeld dat de fenolrood oestrogeen activiteit die de celgroei patroon binnen enkele oestrogeen reageren cellen, daaruit voortvloeiende onnauwkeurig MTT resultaten van invloed kunnen zijn bezit. Om te voorkomen dat dergelijke gevolgen, hebben we gebruik gemaakt DMEM zonder fenol rood 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Stem Cell Technology en Shahid Ghazi Tabriz bedrijven respectievelijk erkennen voor het leveren van DMEM zonder fenol rood en steriel water voor injectie als cadeau.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 t-flask | Orange Scientific | 5510100 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Penicillin 200,000 u/ml | CinnaGen | CR7913 | |
| Streptomycin 200 mg/ml | CinnaGen | CR7912 | |
| trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Superfect | Qiagen | 301105 | |
| Polyfect | Qiagen | 301305 | |
| EGFR antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| Scrambled antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| DMEM without phenol red | GIBCO, by Life Technologies | 11880 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| hemocytometer | HBG | ||
| 8-channel pipette | TreffLab Transferpette | 96.9918.10.1 | |
| Disposable syringe filter | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 2052-025 | |
| Plate reader equipped with 570 nm &630 nm filters | BioTek | ELX808 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 3860-096 | |
| Laminar flow hood | Esco Products | ||
| CO2 Incubator | ASTEC |
References
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH Dependence of 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide-Formazan Absorption on Chemosensitivity Determined by a Novel Tetrazolium-based Assay. Cancer Research. 49, 4435-4435 (1989).
- Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of Lmmunological Methods. 65, 55-55 (1983).
- Yang, M. Energy and Redox States in the C6 Glioma Cells Following Acute Exposure to Zn, Se +4 , and Se +6 and the Correlation with Apoptosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 16 (1), 13-13 (2006).
- Spinner, D. M. MTT Growth Assays in Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer: Methods and Protocols. Bartlett, J. M. S. , Humana Press, Inc. 175-177 (2000).
