Summary
وفحص MTT هو مقايسة سهلة وقابلة للتكرار اللونية لتقييم جدوى الخلية على أساس الحد من MTT الصفراء وانتاج المياه formazan الأرجواني المستعصية. هنا ، وقد تم تقييم جدوى خلايا MCF - 7 على علاج nanogenomedicine.
Abstract
قد السمسة من nanogenomedicine مستقبلية (قصيرة مثل الحمض النووي الريبي التدخل والعقاقير) تعيق تطوره السريري. من هذه ، قد الطب الجيني على أساس و / أو حاملة انتزاع السمية الخلوية. لتقييم هذه السمسة ، منهجية مشتركة تعتمد إلى حد كبير على الاستفادة من 3 -- (4 ، 5 - 2 - ثنائي ميثيل thiazolyl) -2 ، 5 ثنائي الفينيل - 2H - tetrazolium بروميد (MTT) مقايسة التي استخدمت على نطاق واسع نهج اللونية القائمة على نشاط الإنزيمات نازعة الميتوكوندريا في الخلايا. في هذا التحقيق الحالية ، تم تلقيح خلايا MCF - 7 - 96 في طبق بشكل جيد وبنسبة 50 ٪ confluency انهم عوملوا مع nanopolyplexes مختلفة ويتعرضون للفحص MTT بعد 24 ساعة. يتم استقلاب الماء MTT الصفراء للذوبان من قبل خلايا نشطة في عملية التمثيل الغذائي formazan المياه الأرجواني غير قابلة للذوبان ، والتي حلت في زيادة درجة الحموضة عازلة dimethylsulfoxide وSornson ق 10.5. ويمكن قياس هذا المنتج الناتجة من القياس الطيفي باستخدام قارئ لوحة في 570 نانومتر.
Protocol
MCF - 7 البذر في لوحة - 96 أيضا :
وكان المثقف MCF - 7 خلايا في 25 ر القارورة في المتوسط تحتوي متوسطة Dulbecco في التعديل النسر (DMEM) ، و 10 ٪ FBS ، 100 البنسلين يو / لتر ، و 100 الستربتوميسين ميكروغرام / لتر عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2 ، 95 ٪ الهواء والرطوبة كاملة. وقد تم التوصل إلى 90 ٪ مرة واحدة ~ confluency ، أنها منفصلة باستخدام 0.05 ٪ التربسين / EDTA وعدها عن طريق التريبان الأزرق وعدادة الكريات. وكانت هذه الخلايا معلق ثم بتركيز 4 × 10 4 خلية / سم 2 ، وأضاف على 96 لوحة جيدا (أي 250 ميكرولتر / جيد) عن طريق ماصة 8 قنوات. لاستيعاب الخلفية ، وبقيت بعض الآبار خالية من الخلايا ، أي السيطرة على بياض.
علاج الخلايا مع nanopolyplexes مختلفة :
في 40-50 ٪ confluency (48 البذر آخر ساعة) ، وعولج الخلايا المزروعة ذات البنية النانومترية dendrimers polyamidoamine النجمي (أي Superfect و® ® Polyfect) والبوليمر اختبار الرواية التالية التعليمة التي تقدمها ترنسفكأيشن المورد. كما تم علاج الخلايا مع EGFR وسارعت العقاقير وحده ، ومع nanopolyplexes الثلاثة المختلفة لهذه [أليغنوكليوتيد] مع اثنين والبوليمرات (ن = 4). وبقيت أربع آبار غير المعالجة والسيطرة. بعد 4 ساعات تم إزالة وسائل الاعلام العلاج وتتجدد مع وسائل الإعلام الجديدة.
MTT مقايسة لتقييم جدوى الخلية :
أجري فحص MTT بعد 24 ساعة ترنسفكأيشن. لهذا الغرض ، أعدت MTT حل في 1mg/ml في برنامج تلفزيوني ويصفى من خلال مرشح 0.2 ميكرون. ثم تمت اضافة 50 ميكرولتر من MTT زائد 200 ميكرولتر من دون DMEM أحمر الفينول في كل بئر ، باستثناء الآبار خالية من الخلايا الفارغة. وحضنت الخلايا لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2 ، 95 ٪ ونسبة الرطوبة الجوية كاملة. بعد 4 ساعات ، تمت إزالة حل MTT واستبدالها مع 200 ميكرولتر من DMSO و25μl سورنسون في جليكاين العازلة (جليكاين 0.1M ، 0.1M كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة : 10.5 بنسبة 0.1 هيدروكسيد الصوديوم). والمحتضنة لوحة أخرى لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وكان مصمما على الكثافة الضوئية (OD) من الآبار باستخدام قارئ لوحة في الطول الموجي من 570 نانومتر اختبار وطول موجة إشارة من 630 نانومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعتبر فحص MTT أن يكون الأسلوب تنوعا ، وبالتالي يمكن تقييم الجدوى من الخلايا على العلاجات المختلفة. إنتاج formazan الناتجة يبدو متناسبا مع مستوى الأيض الطاقة في الخلايا. ولذلك ، فمن الممكن لقياس خلايا تنشيط عملية الأيض حتى في حالة عدم وجود تكاثر الخلايا. كمية إنتاج formazan يتناسب مع كمية متوسطة MTT في الحضانة. بينما أنتجت تركيز MTT الذي هو مطلوب لتحقيق أقصى قدر ممكن من formazan قد تتغير عند استخدام خطوط مختلفة من الخلايا. الى جانب ذلك ، بعد أن تستخدم هذا الاختبار ، يمكن أن يتم الكشف عن عدد قليل جدا من الخلايا الحية وحدوث أخطاء سيكون ضئيلا منذ ليست هناك حاجة لاتخاذ خطوات الغسيل. امتصاص formazan يختلف مع عدد الخلايا وكذلك درجة الحموضة يمكن التغلب عليها مع اضافة العازلة عند 10.5 درجة الحموضة 1. لون formazan ثابت لمدة بضع ساعات في درجة حرارة الغرفة 2. في حالة وجود أكثر من واحد لوحة ، ينبغي أن تدرج في لوحات التحكم الأخرى أيضا. ومع ذلك ، هذا الأسلوب يعاني من بعض العيوب البسيطة : لا يمكن أ) الخلايا الخاملة أيضيا يكون هناك تمييز مع الخلايا الميتة 3 ، ب) ينبغي أن تكون محمية MTT الحل بعيدا عن الضوء حتى ولو يمكن تخزينه في درجة مئوية (4) لمدة أقصاها شهر واحد 2 ، ج) أنه فشل للتحقق من استقرار المخدرات في المتوسط ، ود) لا يمكن أن الخلايا المستخدمة لاستخدامها في وقت لاحق MTT عن أي فحوصات أخرى.
وينبغي أن أثار الفينول الحمراء تمتص في 570 نانومتر. كذلك ، فقد ذكرت في وقت سابق ان أحمر الفينول تمتلك نشاط الاستروجين التي قد تؤثر على نمط نمو الخلايا داخل بعض الخلايا تستجيب الاستروجين ، التي تلت نتائج MTT غير دقيقة. لتجنب هذه الآثار ، وقد استخدمت نحن DMEM دون الحمراء الفينول 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
فإن الكتاب أن نعترف تقنية الخلايا الجذعية وشركات غازي شهيد تبريز على التوالي لتوفير المياه الفينول DMEM دون الحمراء ومعقم للحقن كهدايا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 t-flask | Orange Scientific | 5510100 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Penicillin 200,000 u/ml | CinnaGen | CR7913 | |
| Streptomycin 200 mg/ml | CinnaGen | CR7912 | |
| trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Superfect | Qiagen | 301105 | |
| Polyfect | Qiagen | 301305 | |
| EGFR antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| Scrambled antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| DMEM without phenol red | GIBCO, by Life Technologies | 11880 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| hemocytometer | HBG | ||
| 8-channel pipette | TreffLab Transferpette | 96.9918.10.1 | |
| Disposable syringe filter | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 2052-025 | |
| Plate reader equipped with 570 nm &630 nm filters | BioTek | ELX808 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 3860-096 | |
| Laminar flow hood | Esco Products | ||
| CO2 Incubator | ASTEC |
References
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH Dependence of 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide-Formazan Absorption on Chemosensitivity Determined by a Novel Tetrazolium-based Assay. Cancer Research. 49, 4435-4435 (1989).
- Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of Lmmunological Methods. 65, 55-55 (1983).
- Yang, M. Energy and Redox States in the C6 Glioma Cells Following Acute Exposure to Zn, Se +4 , and Se +6 and the Correlation with Apoptosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 16 (1), 13-13 (2006).
- Spinner, D. M. MTT Growth Assays in Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer: Methods and Protocols. Bartlett, J. M. S. , Humana Press, Inc. 175-177 (2000).
