Summary
Le test MTT est un test simple et reproductible colorimétriques pour l'évaluation de la viabilité cellulaire basé sur la réduction du MTT jaune et la production d'eau formazan violet insoluble. Ici, la viabilité des cellules MCF-7 sur le traitement des nanogenomedicine a été évalué.
Abstract
La cytotoxicité de l'nanogenomedicine futuristes (par exemple, petits ARN interférents et antisens) peuvent entraver son développement clinique. Parmi ces derniers, la médecine fondée sur les gènes et / ou son transporteur peut susciter une toxicité cellulaire. Pour l'évaluation de la cytotoxicité telle, une méthodologie commune est largement tributaire de l'utilisation de la 3 - (4, 5-diméthyl-2-thiazolyl) -2, 5-diphényl-2H-tétrazolium (MTT) qui a été largement utilisé comme une approche colorimétrique basé sur l'activité des enzymes déshydrogénases mitochondriales dans les cellules. Dans cette enquête, cellules MCF-7 ont été inoculés dans plaque de 96 puits et à 50% de confluence, ils ont été traités avec nanopolyplexes différents et soumis à des test MTT après 24 heures. Eau MTT solubles jaune est métabolisé par les cellules métaboliquement actives pour le formazan violet insoluble dans l'eau, qui est encore dissous dans du tampon pH diméthylsulfoxyde et Sornson s 10.5. Le produit résultant peut être quantifiée par spectrophotométrie en utilisant un lecteur de plaque à 570 nm.
Protocol
MCF-7 semis en plaque de 96 puits:
Cellules MCF-7 ont été cultivées dans 25 t-ballon dans un milieu contenant Medium Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), 10% de FBS, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine à 37 ° C avec 5% de CO 2, 95% air et l'humidité complète. Une fois atteint ~ 90% de confluence, ils ont été détachés en utilisant 0,05% de trypsine / EDTA et comptées par les moyens de bleu trypan et hémocytomètre. Ces cellules ont ensuite été remises en suspension à une concentration de 4 x 10 4 cellules / cm 2 et ajouté sur plaque de 96 puits (ie, 250 ul / puits) par une pipette à 8 canaux. Pour l'absorption de fond, certains puits ont été resté sans cellule, c'est à dire que le contrôle vierge.
Traitement des cellules avec nanopolyplexes différentes:
À 40-50% de confluence (48 heures après l'ensemencement), les cellules cultivées ont été traités avec nanostructurés dendrimères polyamidoamine Starburst (ie, Superfect ® et Polyfect ®) et un polymère nouveau test en suivant les instructions fournies par le fournisseur de transfection. Les cellules ont été également traités avec EGFR et brouillés antisens seul, et avec les trois nanopolyplexes différente de ces deux oligonucléotides et par des polymères (n = 4). Quatre puits ont été n'ont pas été traités comme contrôle. Après 4 heures du traitement médiatique ont été enlevés et reconstituées avec des milieux frais.
MTT pour l'évaluation de la viabilité cellulaire:
MTT a été réalisée 24 heures après transfection. Pour ce faire, la solution de MTT a été préparé à 1mg/ml dans du PBS et a été filtré à travers un filtre de 0,2 um. Ensuite, 50 ul de MTT et 200 ul de DMEM sans rouge de phénol ont été ajoutés dans chaque puits, à l'exception des puits sans cellules vides. Les cellules ont été incubées pendant 4 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2, 95% d'air et d'humidité complète. Après 4 heures, la solution de MTT a été enlevé et remplacé par 200 ul de DMSO et 25 pi de Sorenson tampon glycine (glycine 0,1 M, NaCl 0,1 M, pH: 10,5 à 0,1 NaOH). La plaque a été incubée pendant encore 5 min à température ambiante, et la densité optique (DO) des puits a été déterminée en utilisant un lecteur de plaque à une longueur d'onde de test de 570 nm et une longueur d'onde de référence de 630 nm.
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Discussion
Le test MTT est réputé être une méthode souple et donc la viabilité des cellules peut être évaluée sur divers traitements. La production de formazan résultante semble être proportionnelle au niveau du métabolisme énergétique des cellules. Par conséquent, il est possible de mesurer les cellules métaboliquement actives même en l'absence de prolifération cellulaire. La quantité de formazan produite est proportionnelle à la quantité de MTT dans le milieu d'incubation. Alors, la concentration de MTT qui est nécessaire pour atteindre le montant maximum de formazan produit peuvent varier en fonction de l'utilisation de différentes lignées cellulaires. En outre, après avoir utilisé ce test, très petit nombre de cellules vivantes pouvaient être détectées et l'incidence des erreurs seraient minimes, car il n'est pas nécessaire pour les étapes de lavage. L'absorption de formazan varie avec le nombre de cellules ainsi que du pH qui pourrait être surmonté avec l'addition de tampon à pH 10,5 1. La couleur de formazan est stable pendant quelques heures à température ambiante 2. Dans le cas de plus d'une plaque, les contrôles devraient être inclus dans les autres plaques ainsi. Néanmoins, cette méthode souffre de quelques inconvénients mineurs: a) cellules métaboliquement inactifs ne peuvent pas être discriminés en cellules mortes 3, b) solution de MTT doit être protégé de la lumière, même si elle pouvait être conservés à 4 ° C pour un maximum d'un mois 2, c) il ne parvient pas à valider la stabilité du médicament dans le milieu, et d) les cellules utilisées pour MTT ne peut ensuite être utilisé pour tout autres tests.
Il doit être évoqué que le rouge de phénol absorbe à 570 nm. En outre, il a été indiqué précédemment que le rouge de phénol possède une activité oestrogène qui peuvent affecter le modèle de croissance cellulaire dans certaines cellules répondant aux œstrogènes, qui a suivi les résultats MTT imprécis. Pour éviter un tel effet, nous avons utilisé DMEM sans rouge de phénol 4.
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Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier technologie des cellules souches et Shahid Ghazi entreprises Tabriz, respectivement, pour fournir de l'eau DMEM sans rouge de phénol et stériles pour l'injection comme cadeaux.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 t-flask | Orange Scientific | 5510100 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Penicillin 200,000 u/ml | CinnaGen | CR7913 | |
| Streptomycin 200 mg/ml | CinnaGen | CR7912 | |
| trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Superfect | Qiagen | 301105 | |
| Polyfect | Qiagen | 301305 | |
| EGFR antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| Scrambled antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| DMEM without phenol red | GIBCO, by Life Technologies | 11880 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| hemocytometer | HBG | ||
| 8-channel pipette | TreffLab Transferpette | 96.9918.10.1 | |
| Disposable syringe filter | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 2052-025 | |
| Plate reader equipped with 570 nm &630 nm filters | BioTek | ELX808 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 3860-096 | |
| Laminar flow hood | Esco Products | ||
| CO2 Incubator | ASTEC |
References
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH Dependence of 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide-Formazan Absorption on Chemosensitivity Determined by a Novel Tetrazolium-based Assay. Cancer Research. 49, 4435-4435 (1989).
- Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of Lmmunological Methods. 65, 55-55 (1983).
- Yang, M. Energy and Redox States in the C6 Glioma Cells Following Acute Exposure to Zn, Se +4 , and Se +6 and the Correlation with Apoptosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 16 (1), 13-13 (2006).
- Spinner, D. M. MTT Growth Assays in Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer: Methods and Protocols. Bartlett, J. M. S. , Humana Press, Inc. 175-177 (2000).
