Summary
Der MTT-Test ist eine einfache und reproduzierbare Farbtestverfahren zur Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen basiert auf Reduktion der gelben MTT und Produktion von wasserunlöslichen Formazan lila. Hier hat sich die Rentabilität der MCF-7 Zellen nach Behandlung von nanogenomedicine ausgewertet worden.
Abstract
Zytotoxizität der futuristischen nanogenomedicine (zB short interfering RNA und antisense) behindern können ihre klinischen Entwicklung. Von diesen kann das Gen-basierten Medizin und / oder seinem Träger zu entlocken Zelltoxizität. Für die Beurteilung eines solchen Zytotoxizität, ist eine gemeinsame Methodik weitgehend abhängig von Nutzung der 3 - (4, 5-Dimethyl-2-Thiazolyl) -2, 5-diphenyl-2H-Tetrazolium Bromid (MTT) bestimmt, der weithin als genutzt eine kolorimetrische Ansatz bezogen auf die Aktivität der mitochondrialen Dehydrogenase-Enzyme in den Zellen. In dieser Untersuchung wurden MCF-7-Zellen in 96-Well-Platte angeimpft und bei 50% Konfluenz wurden sie mit verschiedenen nanopolyplexes behandelt und dem Test nach 24 Stunden MTT. Wasserlösliche gelben MTT wird durch die metabolisch aktive Zellen, die in Wasser unlöslichen violetten Formazan, die weiter in Dimethylsulfoxid und Sornson s-Puffer pH 10,5 gelöst metabolisiert. Das resultierende Produkt kann durch Spektrophotometrie mit einem Platten-Lesegerät bei 570 nm quantifiziert werden.
Protocol
MCF-7 Aussaat in 96-Well-Platte:
MCF-7-Zellen wurden in 25 t-Kolben auf ein Medium mit Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), 10% FBS, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin bei 37 ° C mit 5% CO 2, 95% Luft und Feuchtigkeit abgeschlossen. Einmal erreicht ~ 90% Konfluenz wurden sie getrennt mit 0,05% Trypsin / EDTA und gezählt mittels Trypanblau und Zählkammer. Diese Zellen wurden dann in einer Konzentration von 4 × 10 4 Zellen / cm 2 resuspendiert und auf 96-Well-Platte (dh 250 ul / well) von einem 8-Kanal-Pipette. Für Untergrundabsorption wurden einige Brunnen blieb zellfreien, dh als leere Kontrolle.
Die Behandlung von Zellen mit unterschiedlichen nanopolyplexes:
Bei 40-50% Konfluenz (48 Stunden nach der Aussaat) wurden die kultivierten Zellen mit nanostrukturierten starburst Polyamidoamin Dendrimere (dh Superfect ® und Polyfect ®) und ein neuer Test in Polymer nach der Transfektion Anweisung vom Lieferanten zur Verfügung gestellt behandelt. Die Zellen wurden auch mit EGFR behandelt und verschlüsselt antisense allein, und mit den drei verschiedenen nanopolyplexes dieser beiden Oligonukleotide und mit Polymeren (n = 4). Vier Brunnen wurden blieben als Kontrolle unbehandelt. Nach 4 Stunden der Behandlung Medien wurden entfernt und mit frischem Medien.
MTT-Assay für die Bewertung die Lebensfähigkeit der Zellen:
MTT-Assay wurde 24 Stunden nach der Transfektion durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde MTT-Lösung bei 1mg/ml in PBS hergestellt und durch einen 0,2 um Filter filtriert. Dann wurden 50 ul MTT plus 200 ul DMEM ohne Phenolrot in jede Vertiefung gegeben, mit Ausnahme der zellfreien leeren Brunnen. Die Zellen wurden für 4 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2, 95% Luft und vollständige Luftfeuchtigkeit. Nach 4 Stunden wurde der MTT-Lösung entfernt und ersetzt mit 200 ul DMSO und 25 &mgr; l Sorenson Glycin-Puffer (0,1 M Glycin, NaCl 0,1 M, pH: 10,5 mit 0,1 NaOH). Die Platte wurde für weitere 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und die optische Dichte (OD) der Brunnen wurde mit einem Platten-Lesegerät bei einem Test Wellenlänge von 570 nm und einer Referenz-Wellenlänge von 630 nm.
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Discussion
Der MTT-Test gilt als eine vielseitige Methode werden und dementsprechend die Lebensfähigkeit der Zellen könnte auf verschiedene Behandlungen ausgewertet werden. Die Produktion von resultierende Formazan zu sein scheint proportional zum Füllstand des Energiestoffwechsels in den Zellen. Daher ist es möglich, die metabolisch aktivierten Zellen auch in Abwesenheit der Zellproliferation zu messen. Die Höhe der Formazan ist proportional zur Höhe des MTT in das Inkubationsmedium. Während produzierte die Konzentration von MTT, die erforderlich, um maximale Menge an Formazan zu erreichen ist, kann unter Ausnutzung verschiedener Zelllinien zu ändern. Außerdem genutzt haben diesen Test konnte sehr kleine Zahl von lebenden Zellen erkannt werden und das Auftreten von Fehlern wäre minimal, da gibt es keine Notwendigkeit für Waschschritte. Die Absorption von Formazan variiert mit der Zellzahl sowie pH-Wert, mit Zugabe von Puffer bei pH 10,5 1 konnte überwunden werden. Die Farbe des Formazan wird für ein paar Stunden bei Raumtemperatur 2 stabil. Im Falle von mehr als einer Platte, sollten Kontrollen in anderen Platten enthalten als gut. Trotzdem leidet diese Methode von einigen geringfügigen Nachteile: a) metabolisch inaktiven Zellen können nicht mit toten Zellen 3, b diskriminiert werden) MTT-Lösung vor Licht geschützt werden sollen, obwohl es konnte bei 4 ° C für maximal 1 Monat 2 gespeichert werden, c) es versäumt, Drogen Stabilität in das Medium zu validieren, und d) Zellen für MTT verwendet kann nicht nachträglich für andere Assays verwendet werden.
Es sollte hervorgerufen, dass Phenolrot bei 570 nm absorbiert werden. Ferner hat es zuvor berichtet, dass die Phenolrot Östrogen-Aktivität, die das Zellwachstum Muster innerhalb einiger östrogenempfindlichen Zellen, daraus ungenaue MTT Ergebnisse beeinflussen könnten, besitzt. Zur Vermeidung solcher Auswirkungen, haben wir DMEM ohne Phenolrot 4 verwendet.
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Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Stem Cell Technology und Shahid Ghazi Tabriz Unternehmen bzw. anerkennen, für die Bereitstellung von DMEM ohne Phenolrot und steriles Wasser zur Injektion als Geschenk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 t-flask | Orange Scientific | 5510100 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Penicillin 200,000 u/ml | CinnaGen | CR7913 | |
| Streptomycin 200 mg/ml | CinnaGen | CR7912 | |
| trypsin/EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Superfect | Qiagen | 301105 | |
| Polyfect | Qiagen | 301305 | |
| EGFR antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| Scrambled antisense | Eurofins MWG Operon | ||
| DMEM without phenol red | GIBCO, by Life Technologies | 11880 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| hemocytometer | HBG | ||
| 8-channel pipette | TreffLab Transferpette | 96.9918.10.1 | |
| Disposable syringe filter | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 2052-025 | |
| Plate reader equipped with 570 nm &630 nm filters | BioTek | ELX808 | |
| 96-well plate with lid (flat bottom) | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 3860-096 | |
| Laminar flow hood | Esco Products | ||
| CO2 Incubator | ASTEC |
References
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH Dependence of 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide-Formazan Absorption on Chemosensitivity Determined by a Novel Tetrazolium-based Assay. Cancer Research. 49, 4435-4435 (1989).
- Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of Lmmunological Methods. 65, 55-55 (1983).
- Yang, M. Energy and Redox States in the C6 Glioma Cells Following Acute Exposure to Zn, Se +4 , and Se +6 and the Correlation with Apoptosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 16 (1), 13-13 (2006).
- Spinner, D. M. MTT Growth Assays in Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer: Methods and Protocols. Bartlett, J. M. S. , Humana Press, Inc. 175-177 (2000).
